ABI的使用维护以及校准标准操作程序文档格式.docx
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点击“FileNew...,”就会弹出“newdetector菜单”
在“newdetector窗口”进行样本信息输入:
1)在“Name”可以输入:
按自己的喜好输入易于区分的name。
2)在“ReporterDye选”择所用试剂探针所采用的报告基团如:
FAM
3)在“QuencherDye选”择所用试剂探针所采用的报告基团如:
TAMRA
4)在“Color点”击右侧颜色小方格后可以按自己的喜好选择颜色。
5)设置好此后点击OK会回到“detectormanager窗口”
在“detectormanager窗口”依次点击“AddToPlateDocument、”“Done。
完成了Detector的设置;
会重新回到“WellInspector菜单”,请做以下设置:
1)在“PassiveReference选折”None;
2)在“Use下”的小方框中打勾;
3)在“SampleName一”般在参照标准品反应孔中习惯性的输入:
试剂批次号如:
HBV2006018。
设置好此后关闭“WellInspector菜单”。
设置循环条件:
在Plate面板中选中“Instrument,通”过面板上的“AddCycle、”“AddStep、”
“DataCollection等按”钮,参照试剂说明书设置好“Instrument面板”。
选择File(文件)>
SaveAs(另存为),为绝对定量反应板文件输入一个文件名,尔后单击Save(保存)。
推开滑门,依照面板设置放好自己的试验样品,关闭仓门。
按下Start开始PCR实验。
在仪器运行PCR程序期间,Instrument(仪器)选项卡上
会显示实时状态信息,并报告荧光信号强度。
程序运行结束后,状态值和按钮变为灰色,而且Analysis(解析)按钮()变为可用状态,并显示信息提示您程序可否成功运行。
程序运行期间生成的全部数据都保存到步骤中指定的绝对定量反应板文件中。
在反应结束后按Save键储蓄实验结果,关闭扩增仪电源开关。
实验结果解析。
试验结束,为保险起见,可再次保存试验结果到指定目录,尔后打开试验结果*.sds
文件
点击“result下有”“Plate、Spectra、Component、AmplificationPlot、StandardCurve、
Dissociation、Dissociation、Report”7个子目录。
一般我们用“AmplificationPlot项来观”察每孔的扩增实时曲线
“AmplificationPlot项的曲”线有“log值”和“求导后的线性值”的2种表现形式,经过
“Tool→GraphSettings...或经过”鼠标左键双击非曲线区依次选击“linear”→“将OK”
“log值”变换到“线性值”曲线。
您可以经过点击每个孔来观察所对应的扩增的曲线来判断该孔的结果。
一般:
依次看:
“N”→“4S并”(设置好T值和基线)
【定量:
是指经过已知的标准参照品来判断未知】设置好T值和基线后,尔后选中“N+4S”按住键盘Ctrl不放手,依次点击/再点击某未知样品孔来判断该孔样品的扩增曲线,并结合“Plate、”“Report”子目录来定量该孔样品的Qty值。
保护方法
微软件WindowsNT工作站的保护
硬盘驱动器每个月29日左右运动一次碎片除去程序,使用NortonUtilities或近似软件。
详尽步骤:
放入NortonUtilities光盘。
MyComputer打开NortonUtilities软件光盘。
启动清理碎片/优化程序。
d)运行完成后,检查以确信无严重错误记录,退出NortonUtilities。
a)取出NotonUtilities光盘,重新启动计算机。
b)CR仪的保护
c)样品槽的干净
d)样品槽每个月29日左右进行一次干净,如出现样品槽污染情况则随时干净。
操作方法:
e)确定污染物的本源和地址:
用少量的去离子水,干净样本块中包括污染物的反应孔.
f)执行背景校正后,还是发现有些孔中还有污染物时用少量95%EtOH溶液,干净样本块中包括污染物的反应孔.
g)执行背景校正后,还是发现有些孔中还有污染物时用少量10%漂白溶液,干净样本块中包括污染物的反应孔,直至污染物去掉
h)若是依旧存在污染物,请与美国应用生物系统公司技术支持联系.
i)ABIPRISM7300光路系统的保护
j)调准ROI参照条
k)调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器如期校准或仪器维修后进行。
不得由一般实验人员进行该项操作。
l)PCR仪样品槽中放入荧光检测板。
m)将ABIPRISM7300光源检测器向前拖动盖信样品槽,并旋紧。
n)从Start菜单项选择择运行ABIPRISM7300SDS管理软件。
o)积分时间从1024ms开始,用地址调整后,调治ROI的高度与右侧线。
p)逐渐增加积分时间,直到可以看到最少四个块(约4096ms)经过。
q)调整最左侧地址调整点。
r)减少积发时间到2048ms,调整上方与底部的地址调整点。
s)减少积分时间以便最右侧块可见但未饱和(约1024ms),调治最右侧地址调整点。
如有需要用右上角拖动点调整图像的倾斜度(以左上角为中心旋转)。
t)调治后的参照条宽度必定在ROI参照块间有小空隙。
u)校正ROI光路
v)ROI光路校正每个月29日左右进行一次,以便确信结果依旧是优化的。
w)在PCR仪样品槽中放入荧光检测板。
x)将ABIPRISM7300光源检测器向前拖动遮住样品槽,并旋紧。
y)从Start菜单项选择择运行ABIPRISM7300SDS管理软件。
zz)点选ShowROI复选框。
每个样品也周围出现一蓝色椭圆圈。
aa)点选ShowSaturation复选框。
bb)设定积分时间为1024ms;
打开卤素灯和光闸。
cc)点击LIVE按钮获得图像,尔后在任何地方左击停止。
获得中等程度未饱和图像(无红色图像)。
dd)从Edit菜单中选择CalibratePOIs每个孔采用合适的ROI,确定96孔都被蓝色椭圆圈正确界定。
ee)i)图像太亮太暗都会出现错误信息,相应增加或减少积分时间,并重复上述第8步直到
ff)无错误信息出现。
gg)j)检查也ROI公司,全部孔住处都应包括在96个ROI椭圆圈中。
若是没有,重复8和
hh)步。
ii)检查PCR仪样品槽的荧光污染
jj)检查PCR仪样品槽的荧光污染每个月5日进行一次,如有需要随时进行。
kk)开启ABIPRISM7300型核酸扩增荧光检测信电源。
ll)从Start菜单项选择择运行ABIPRISM7300SDS管理软件。
mm)从样品槽中移去反应板。
nn)将ABIPRISM7300光源检测器向前拖动遮住样品槽,并旋紧。
oo)设定积分时间为1024ms;
pp)点击LIVE按钮获得图像,尔后在任何地方左击停止。
a)观察96孔中背景荧光,如孔有显着荧光则表示该孔存在荧光污染。
b)按依旧品槽的干净程序冲刷样品槽。
c)更换卤素灯
d)仪器使用大体2000小时后应更换卤素灯,但详尽要示卤素灯本质情况而定。
e)关闭ABIPRISM7300型核酸扩增荧光检测仪,冷却15分钟。
f)移去ABIPRISM7300光源检测器顶盖。
g)移去卤素灯顶盖。
h)把旧灯泡从插座中滑出,更换新卤素灯。
确信灯正确安装在地址上。
滑动灯泡时要轻轻抬起灯以避开装置螺丝钉。
重新装上灯顶盖和ABIPRISM7300光源检测器顶盖。
开启ABIPRISM7300型核酸扩增荧光检测仪电源,运行ABIPRISM7300SDS管理软件。
经过软件控制卤素灯开关,确认灯随开关开闭。
开启光闸,确认光闸可打开。
设定积分时间为1024ms,点击LIVE。
保证要以采集一幅数据图像。
若新卤素灯不工作,ABIPRISM7300电源保险管可能有问题。
也可以用自动调治光源.
424、校准:
ABI7300基因扩增检测仪校准工作需由专业工程师进行,每年校正一次,别的以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准供应信息。
经过对室内质控图的解析,实时发现系统误差的出现。
经过解析除去了试剂和人员误差后,应进行仪器状态校验实验:
使用标准化试剂作为校验试剂,分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。
每年10月由固定人员进行上述实验,仪器若搬动或配套仪器(如UPS等)的变动亦
需进行上述实验,观察标准曲线的三个参数可否处在控制范围和103标准品可否检出。
当103标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时,先除去实
验的人员、试剂因素,再重复实验。
如结果依旧,联系厂家进行仪器校准。
当仅有103标准品未检出时,检查实验全过程。
再次上机检测
103标准品两枚。
如仍未
检出,则联系厂家进行仪器校准。
仪器经过校准后,重复该实验,结果归入仪器档案。
注意事项:
仪器应放置在水平坚固的平台上,外界电源系统电压要般配,并要求有优异的接地线。
环境温度保持在23℃左右,湿度保持在60%
仪器应装备功率≥3000w的稳压器。
仪器应如期干净保护。
仪器使用时应严格遵守上述使用步骤。
5、扩增解析程序
核酸扩增标准程序
扩增反应前须先在ABIPRISM7300职SDS软件的设置面板上依照早先排好的标当地址进行设置。
每次实验除了待检标本,还要包括一个阴性比较、一个阳性比较、一个阳性室内质控品、一组阳性标准品(4个梯度107、106、105、104)。
依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关,进入
WindowsNT界面。
接关打开光源检测器和PCR仪电源开关,预热
5分钟。
击ABIPRISM7300SDS图标,打开软件。
在NewplateApplication窗口分别选定ABIPRISM7300/SYBRGreen,尔后单击OK,打开一空白设置面板。
在Setup版面设定样品种类与名称,数量。
a)在Type栏中选择种类:
STND-标准梯度,UNKN-未知样品,
b)NTC-阴性比较,Notinuse–未使用。
c)再在Name栏中依次输入样品名称
d)c)在框定所选标准梯度孔数后,需在工具栏中单击P窗口,选定PR1PrimerSYBR后,
e)关闭窗口,可见所选孔左下角有一长方形阴影。
f)在框定所选孔数后,在工具栏中单击Q窗口,即可在此窗口输入定值标准品的标准量。
g)点击Instrument即可在此窗口设定循环参数。
h)采用定任务栏File中的Save项,弹出对话框。
在对话框中的FileName项下输入一
i)组数字和(或)字母组成的文件名,选Save.
j)检查设置正确与否。
k)运行程序:
l)在设置完程前言件Instrument窗口,点RUN键,即可运行。
m)反应结束后,选任务栏File中的Save项,保存实验结果。
结果解析标准程序
a)对于ABIPRISM7300结果曲线的解析,应按以下步骤进行:
全部曲线——阴性比较——阳性比较——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个解析(标出阳性标本和可疑标本)——调整参数,获得较好的标准曲线,显示定量结果——登记,发报告。
b)整体曲线的观察
c)将全部曲线选中进行整体观察
d)观察可否存在污染情况(包括标本污染和试剂污染),特别应注意大量曲线在同一Ct值出现上涨的情况。
e)观察可否有光跑传导阻滞或电压颠簸等机器原因形成的异常曲线。
f)阴性比较的解析
g)阳性比较:
试剂中加入与待检标本进行同样办理的已知阳性标本。
h)作用:
用以监测实验可否正常检出阳性标本,防备假阴性的出现。
i)阳性室内质控品的解析
j)阳性室内质控品:
试剂中加入与待检标本进行同样办理的已知和未知浓度的阳性室内质控血清。
k)作用:
用以监控平时实验的精美度。
l)阳性标准品的解析
m)各梯度曲线的分布可否均匀,若各梯度曲线均未分开,则表示阳模稀释可能存在问题,提示实验中存在较大人为误差。
n)观察各曲线的Ct值可否在平时的正常地址。
情况
1:
若出现低拷贝标准品做不出,而各曲线Ct值均后移,则判断可否为试剂扩增效
率下降(如试剂过期或保存条件不合格)。
2:
出现低拷贝标准品做不出,而高拷贝曲线Ct值均正常,则提示可能存在低拷贝
阳性标准品的降解情况。
每日必估103标准品,用作以下三方面监控:
一可否存在操作误差,如加样量过少等原因以致103标准品未能检出;
二可否存在稀释后的梯度放置过久,低拷贝标准品降解的情况;
三是若高拷贝标准品出现Ct值后移,且能除去情况A、V,则判断可否为试剂矫捷度下降。
单个曲线的判断
逐个解析每条曲线,判断曲线的阴阳性或属可疑曲经。
(可疑标本是指曲线在27个Ct值后出现上小组长且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。
可疑标本要第二天重做,两次结
果一致则报阳性,否则结果报阴性。
)曲线观察内容:
在基线选择2-8时观察△Rn值大小(可否有三期特色)。
在基线选择0-0时观察Rn值曲线形状。
得出定量结果
调治基线和阈值以获得一较好的标准曲线。
电脑据此曲线给出阳性结果值。
此时就排队某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。
发放报告
实时登记检测结果记录,发放临床报告。
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