荧光法测定维生素CWord文档格式.docx

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邻苯二胺（1,2-diaminobenzene，江阴市华亚化工有限公司）：

4.0×

10-4g/mL

水杨酸（2-Hydroxybenzoicacid，宜兴市辉煌试剂厂）：

4.0×

苯甲酸溶液（Benzoicacid，BA，国药集团试剂有限公司）：

1.0×

硫酸高铁氨溶液（Ammoniumiron，国药集团试剂有限公司）:

2.0×

10-3g/mL

维生素C（vitaminC，国药集团试剂有限公司）：

准确称取0.0500克，配制到100ml容量瓶，可制得5.0×

10-4g/mL的储备液（避光密封2到8°

C）。

维生素C工作液：

10-5g/mL，使用时用去离子水由储备液逐级稀释。

氢氧化钠（SodiumHydrate，）：

0.2mol/L

硼酸（BoricAcid，国药集团试剂有限公司）：

0.2mol/L

磷酸二氢钾（potassiumdihydrogenphosphate;

monopotassiumphosphate，上海试剂有限公司）：

磷酸二氢钠（sodiumdihydrgenphosphate，江苏太仓化工厂）：

0.2mol/L

氯化钾（PotassiumChloride，中国上海试剂一厂）：

盐酸（hydrochloricacid，中国宿州化学试剂有限公司）：

邻苯二甲酸氢钾（potassiumacidphthalate，汕头市西陇化工厂有限公司）：

无水乙醇（absolutealcohol;

anhydrousethanol上海展云化工有限公司）

硼砂（四硼酸钠）（sodiumtetraborate，中国云岭化工厂）：

0.2mol/L

Vc药片：

湖北华中药业有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1249

上海玉安药业有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1445

南京白敬宇制药有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1486

上海信谊黄河制药有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1540

1.3实验方法

于10mL比色管中依次加入1.00mLVc工作液，2.5mLbuffer，1.5mL苯甲酸，去离子水稀释定容至刻度,测定荧光光谱。

同时在λex/λem=310nm/410nm处，测定荧光强度F。

同时测定试剂空白（2.5mLbuffer，1.5mL苯甲酸）的荧光强度F0,F1=F-F0。

2荧光底物的选择

2.1邻苯二胺

取Vc工作液（1ml）+硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+邻苯二胺（2ml）测得荧光强度F，取硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+邻苯二胺（2ml）测得荧光强度F0，测得荧光值如表1。

表1pH值对邻苯二胺体系荧光的影响

pH

1

6

8

9.2

F

374.1

1506

1477

1476

F0

67.53

1396

1585

1565

F-F0=F1

306.57

110

-108

-89

图1pH值对邻苯二胺体系荧光的影响

由图1可看出邻苯二胺本身具有较强的荧光强度，而且与Vc反应生成产物所促的荧光值很小。

2.2水杨酸

取Vc工作液（1ml）+硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+水杨酸（2ml）测得荧光值如表2。

表2pH值对水杨酸体系荧光的影响

329

758

2164

1978

271.1

577.3

2056

2484

57.9

180.7

108

-506

图2pH值对水杨酸体系荧光的影响

由图2可以看出，水杨酸也具有很强的荧光强度,与Vc反应所增荧光值很小。

2.3苯甲酸

取Vc工作液（1ml）+硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（2ml）测得荧光值如下表。

表3pH值对苯甲酸体系荧光的影响

1.2

7.6

8.4

7.33

148

74.83

49.19

6.273

47.98

24.85

17.64

1.057

100.02

49.98

31.55

图3pH值对苯甲酸体系荧光的影响

根据图3可以看出，苯甲酸体系荧光增强非常明显，故本文选用苯甲酸作为荧光底物进行下一步研究。

3.实验结果与讨论

3.1荧光光谱

BA用量（1ml），buffer用量（2.5ml），Vc用量（1ml）不同组合的体系荧光光谱图叠加如下图：

从图中我们可以看出，曲线4、5、6、7、8（对应苯甲酸+缓冲，缓冲，去离子水，维生素C+缓冲，维生素C）均没有荧光，曲线2、3（对应维生素C+苯甲酸，苯甲酸）有荧光但荧光强度很弱，1号荧光强度非常强，我们可以知道Vc+BA+buffer体系所促荧光最佳。

由上图可见，在苯甲酸体系中加入不同量的维生素C，体系的荧光发生有规律的增强。

从而建立了荧光光度法测定维生素C的方法。

3.2酸度的影响

取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2ml）测得荧光强度为F，取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+缓冲溶液（2ml）测得荧光强度为F0。

酸度对体系的荧光强度有很大的影响，见下表与下图。

表4pH值对体系荧光的影响

F1

2

7.974

7.866

0.108

2.8

22.92

24.83

-1.91

3.6

33.67

29.87

3.8

4.4

30.62

32.31

-1.69

5.2

79.25

14.02

65.23

6.8

69.14

35.57

33.57

图4酸度对体系的荧光强度的影响

由图可以看出，在pH=1.2～8.4之间，体系的ΔF先增大而后降低，在pH=6.0时，体系的ΔF值达到最大，故本文选择pH=6.0的0.10molL-1的缓冲体系进行进一步的研究。

3.3不同缓冲体系的影响

取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+不同体系缓冲溶液（2ml）定容测得荧光强度为F，取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+不同体系缓冲溶液（2ml），定容测得荧光强度为F0。

不同缓冲体系的荧光强度有较大的影响，见下表与下图。

表5不同缓冲体系对苯甲酸体系荧光的影响

缓冲体系

△F

251.4

70.4

181

214.2

71.11

143.09

3

126.7

37.56

89.14

4

437.9

96.55

341.35

5

822.2

152.9

669.3

图5不同缓冲体系对苯甲酸体系荧光的影响

1.磷酸二氢钾—NaOH2.柠檬酸钠—NaOH3.乙酸—乙酸钠

4.磷酸二氢钾—硼砂5.NaOH—邻苯二甲酸氢钾

由图可以看出，当缓冲体系为NaOH—邻苯二甲酸氢钾时，体系的ΔF值达到最大，故本文选择pH=6.0的NaOH—邻苯二甲酸氢钾缓冲体系进行进一步的研究。

3.4缓冲体系体积的影响

取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液不同体积定容测得荧光强度为F，取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+缓冲溶液不同体积定容测得荧光强度为F0。

缓冲体积对体系的荧光强度也有一定影响，见下表与下图。

表6pH值对苯甲酸体系荧光的影响

V（缓冲溶液）

7.7

6.339

1.361

0.5

142

90.38

51.62

200.2

130.5

69.7

1.5

230.8

142.8

88

255.2

156.6

98.6

2.5

255

160.8

94.2

257.4

158.7

98.7

3.5

258.7

153.1

105.6

267.1

171.4

95.7

266.3

168.5

97.8

图6pH值对苯甲酸体系荧光的影响

由图可以看出，当缓冲溶液用量为2.5ml时，体系的ΔF值达到最大且保持稳定，故本文选择pH=6.0的NaOH—邻苯二甲酸氢钾2.5ml缓冲溶液进行进一步的研究。

3.5Fe3+用量的影响

苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2ml）分别加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mlFe3+溶液，定容测得荧光强度F，苯甲酸（2ml）+缓冲溶液（2ml）分别加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mlFe3+溶液，定容测得荧光强度F0。

表7氧化剂Fe3+用量对体系荧光强度的影响

V

2310

528.6

1781.4

1468

579

889

658.4

324.9

333.5

324.7

141.2

183.5

134.7

82.94

51.76

62.64

44.31

18.33

18.6

22.67

-4.07

图7氧化剂Fe3+用量对体系荧光强度的影响

由图可以看出，不添加铁离子时，体系荧光增强数值△F最大，所促荧光强度更强一些，效果更佳。

3.6加入顺序的影响

苯甲酸（BA）1.5ml，缓冲（bf）2.5ml，工作液Vc（Vc）1.0ml

试验了不同的加入顺序对体系的荧光强度的影响，结果见下表。

表8不同加入顺序对体系荧光强度的影响

顺序X

1.BA+VC+bf

675.1

240.1

435

2.BA+bf+Vc

713.9

203.7

510.2

3.bf+BA+Vc

594.5

394

200.5

4.bf+Vc+BA

733

188.2

544.8

5.VC+BA+bf

701.1

185.5

515.6

6.VC+bf+BA

813.3

179.2

634.1

图8不同加入顺序对体系荧光强度的影响

由图8可以看出，试剂的加入顺序对该体系的荧光强度有一定影响。

本文选择按6的顺序加入。

即先加入Vc，然后是缓冲溶液，最后加入BA为最佳条件。

3.7时间的影响

取Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（2ml）定容测得荧光强度为F，取缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（2ml）定容测得荧光强度为F0。

表9反应时间对体系荧光强度的影响

t/min

383

93.05

289.95

452.7

105.3

347.4

10

579.6

135.3

444.3

15

676.7

154.6

522.1

20

748

195.8

552.2

25

823.7

212.7

611

30

852.7

235

617.7

35

893

251.3

641.7

40

911.3

272.8

638.5

45

939.4

292.7

646.7

50

954.2

305.9

648.3

55

985

312.2

672.8

60

999.4

337.6

661.8

65

1028

344.5

683.5

70

1034

353.1

680.9

75

1055

362.5

692.5

80

1058

382.3

675.7

90

1078

395.3

682.7

95

1073

410.8

662.2

105

1121

430.2

690.8

图9反应时间对体系荧光强度的影响

由图可以看出，反应体系的荧光增强数值△F在35min达到最大,几乎不受反应时间的影响,且至少在105分钟内ΔF基本保持不变，故本文要求在35分钟以后105分钟内完成测定。

3.8温度的影响

分别放在25、30、35、40温度下反应三十分钟测得荧光强度如下表

表10反应温度对体系荧光强度的影响

温度

1次F

614.9

488.8

1990

998.2

1次F0

303.5

416.8

1320

992.5

2次F

585.6

2777

3481

657.6

2次F0

306.3

2434

3412

550.7

由表中数据可以看出，在高温条件下其荧光值，极其不稳定，所以本文直接在常温条件下测定最佳。

3.9苯甲酸用量的影响

取Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2.5ml）+不同体积苯甲酸，定容，测得荧光强度为F，取缓冲溶液（2ml）+不同体积苯甲酸，定容，测得荧光强度为F0

苯甲酸的用量对体系的荧光△F程度有一定影响见下表下图:

表11苯甲酸用量对体系荧光强度的影响

V（苯甲酸）

431.3

436.6

-5.3

579.2

178.8

400.4

613.5

163.8

449.7

722.6

172.5

550.1

619.4

158.6

460.8

594.1

173.3

420.8

689.4

168.8

520.6

图10苯甲酸用量对体系荧光强度的影响

由图可以看出，当苯甲酸（BA）溶液用量为1.5ml时，体系的ΔF值达到稳定，故本文选择苯甲酸（BA）溶液加入量为1.5mL进行进一步的研究。

3.10表面活性剂的影响

取活性剂溶液（0.5ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F，取活性剂溶液（0.5ml）+缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F0。

表12不同表面活性剂对体系荧光强度的影响

活性剂

3.0×

10-6OP乳化剂浓度

555.8

215.3

340.5

1.5×

10-4聚山梨酯-80浓度

440.3

199

241.3

CTMAB

570.5

239

331.5

空白

439.1

189.7

249.4

图11不同表面活性剂对体系荧光强度的影响

图12OP乳化剂的发射光谱图

由图可以看出，活性剂1与4相比较虽然ΔF较大，但是OP本身荧光值很大高达1088，活性剂3虽然ΔF值比较大，但是其F0较大，活性剂2和4相比无差别，所以我们选择不添加任何表面活性剂。

3.11共存离子干扰试验

测定浓度为1.0×

10-5g/mL的维生素C时较低浓度钠离子、钾离子没有干扰，而铝离子、钙离子、铁离子、卤离子、溴离子、硫酸根离子在较低浓度对荧光强度有猝灭强度。

3.12工作曲线的制备

准确称量Vc分析纯0.0522g到100ml容量瓶配得储备液，取2ml储备液到100ml容量瓶定容所得工作液浓度为1.044×

10-5g/ml,取新配置的Vc工作液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml，与10ml比色管中，再加缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F，缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F0。

V（工作液）

250.8

412.8

247.4

165.4

543.9

240.5

303.4

718

248.6

469.4

980.8

246.9

733.9

1268

249.6

1018.4

1544

252.4

1291.6

1880

243.8

1636.2

由上图和表可见，加入维生素C后，体系的荧光强度有规律的明显增强，线性关系良好。

线性方程为：

Y=464.14X—109.96,R2=0.977（R=0.988）

4.样品测定结果

研磨一片Vc药片，在分析天平称取0.0010g左右粉末配置到25ml容量瓶中，下面是不同厂家药片的测定结果：

A.湖北华中药业有限公司B.上海玉安药业有限公司

C.南京白敬宇制药有限公司D.上海信谊黄河制药有限公司

药品

称量Vc一粒药片质量

理论药片Vc含量

Vc理论浓度g/ml

A

0.0010

80.06%

3.2×

10-5

B

0.0015

69.20%

4.15×

C

0.0018

67.29%

4.85×

D

0.0017

64.94%

4.42×

分别取药片溶液上清液（0.5ml）+缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（1.5ml）比色管中，测得荧光值结果如下表：

625.3

701.6

664

819

935

998

259.4

F1=F-F0

365.9

442.2

404.6

559.6

675.6

738.6

平均

404.2

657.9