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顶空-气相色谱分析的应用实例:
(1)生物样本中挥发性有机物的测定,如香樟树色谱指纹图谱的建立;
(2)药品中有机溶剂残留的测定;
(3)有机聚合材料中挥发性有机物的分析,如苯系物的分离测定;
(4)环境分析;
(5)挥发油分析;
(6)烟草行业的应用
2指纹图谱含义
指纹图谱是指将研究对象经过适当处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标示其化学特征的共有峰的色谱图或者光谱图等。
形象地讲,木材指纹图谱就是木材的身份证,该木材的主要化学信息都能体现在指纹图谱上,指纹图谱使木材一材一图,决不混淆。
指纹图谱具有模糊性和整体性等特点。
从分子水平研究木材的化学成分,进而建立木材的指纹图谱具有重要的理论意义和实际需要。
建立好木材的指纹图谱,就可以进行木材识别。
要把识别技术建立在研究清楚每个内含成分的基础上,很不现实。
这就要求,在尚不清楚全体化学成分的情况下,实现对物质群整体的控制。
而现代色谱、光谱、波谱、质谱等仪器分析所得物质群指纹图谱,展现了这种可能性。
几个物质群在相同仪器、相同试验条件、相同操作方法下所得的指纹图谱相同性,即可反映这些物质群的同属性。
虽然对图谱中每个特定峰的成分并不了解,也即对物质群的化学成分并不全知晓,但这并不影响对物质群一致性的判断。
以香樟木为例,设定以下实验条件:
进样口温度为230℃;
进样体积为400μL;
进样针温度为100℃;
振荡器温度为80℃;
振荡器加热时间为10min;
检测器温度为260℃。
柱温升温程序:
起始温度60℃,保持0.5分钟后以每分钟20℃的升温速率升至100℃,保持3分钟后以每分钟6℃的升温速率升至180℃,保持0.5分钟后以每分钟10℃的升温速率升至200℃。
在以上实验条件下,得到其色谱总离子流图谱如图2所示。
图2香樟色谱指纹图谱
3模式识别与主成分分析原理
用不同的木材标准样品按照优化后的色谱条件进行实验后,在计算机系统里保存各木材标准样品的色谱指纹图谱数据。
用同样的色谱方法对待检验木材样本进行检测,然后将获得的色谱图数据与标准库进行对比,就可以判定待检验样本属于哪类木材样本,从而实现模式识别。
模式识别是指对表征事物或现象的各种形式的(数值的、文字的和逻辑关系的)信息进行处理和分析,以对事物或现象进行描述、辨认、分类和解释的过程,是信息科学和人工智能的重要组成部分。
模式识别方法很多。
在本实验中,主要采用统计模式识别。
统计模式识别的基本原理是:
有相似性的样本在模式空间中互相接近,并形成“集团”,即“物以类聚”。
其分析方法是根据模式所测得的特征向量Xi=(xi1,xi2,…,xid)T(i=1,2,…,N),将一个给定的模式归入C个类ω1,ω2,…,ωc中,然后根据模式之间的距离函数来判别分类。
其中,T表示转置;
N为样本点数;
d为样本特征数。
统计模式识别的主要方法有:
判别函数法,k近邻分类法,非线性映射法,特征分析法,主成分分析法等。
本实验主要采用主成分分析法来对木材进行模式识别。
简要介绍一下主成分分析方法。
分析手段的仪器化和化学体系的复杂化已成为现代分析化学学科的两大重要特征。
与其同时,化学计量学也迅速发展起来。
从现代化学计量学的观点看,仪器分析数据的传统处理方法“如对光谱、波谱只取其峰值,对色谱只计算其面积等,这样做的后果只能造成大量有用信息的浪费。
面对形形色色的多组份体系,在充分利用化学量测仪器所产生的化学信号特点的基础上,化学计量学运用统计学和应用数学及计算机,最大限度地从中抽取不同特性样本中的定性、定量化学信息。
色谱联用技术的实验结果常用多种指标来表征,如果希望综合使用这些指标,就可以通过主成分分析方法把数据的维数降低。
主成分分析在尽量不损失数据中的信息的前提下进行,其目的是从原始的多个变量取若干变量进行线性组合,以尽可能多地保留原始变量中的信息,新变量互不相关即正交。
本实验中,对所获得的待检验样本色谱图数据进行主成分分析,然后进行主成分分析投影,根据物以类聚的原则,相似的物质聚集在相邻的区域。
如果将数据库中标准样品和待检验样品的色谱数据综合处理,则可以将待检验样本与标准样品进行聚类分析,从而实现待检验木材样品的模式识别。
聚类分析是一种分类学与多元分析相结合的多元统计方法,它将分类对象置于一个多维空间中,按照空间关系的亲疏程度进行分类,即根据事物彼此不同的属性进行辨认,将具有相似属性的事物聚为一类,使同一类的事物具有高度的相似性。
本质上,聚类分析是按“物以类聚”的原则将特性相近的变量或观察单位进行分类。
聚类分析是一种探索性的分析。
聚类分析可以分为层次聚类分析和快速聚类分析。
层次聚类分析中根据聚类的对象不同分成Q型聚类和R型聚类。
Q型聚类是针对样本进行聚类,它使具有相似特性的样本聚集在一起,使差异性大的样本分离开来;
R型聚类是对变量进行聚类,它使具有相似性的变量聚集在
一起,差异性大的变量分离开来,实现减少变量个数。
快速聚类分析主要用于样本量过多或异常庞大的情况。
在本实验中,利用excell的相关功能对获得的各待检验样本色谱图数据进行对齐各样本的保留时间等预处理,然后计算各待检验样本色谱图峰面积与标准样品峰面积之间的相关系数。
相关系数越高,说明两种物质化学性质越相似,类别越相近;
反之,则表明类别关系越远。
4数据处理
首先要结合线性代数知识,理解所获得色谱图的数据构成和所代表的化学意义。
简要介绍用Metlab编程语言如何进行主成分分析法投影分类。
实施该算法的具体步骤是,将待检验样品量测所得数据矩阵(设为Y)进行一定的预处理,然后导入Metlab工作环境中,输入命令[U,S,V]=svd(Y)进行奇异值分解,取U矩阵中的前两列矢量分别作为第一主成份(横轴)和第二主成分(纵轴),作二维平面图,即可以直观地观察到各个待检验样本所处空间。
图3为两种不同木材作了共5个批次的实验后运用主成分分析法投影后进行模式识别的结果。
其中一种是两个香樟样本,为图中标号4,5处;
另外一种是三个松树样本,为图中标号1,2,3处。
由图可知,分类效果明显。
图4PCA投影用于树皮模式识别结果
参考资料:
1王立汪正范等《色谱分析样品预处理》化学工业出版社
2陈培容李景虹邓勃《现代仪器分析实验与技术》清华大学出版社
3许禄等《化学计量学方法》北京科学出版社2004
4宋国新等《香气分析技术与实例》北京化学工业出版社2008
5魏宁漪等。
顶空进样和固相魏萃取进样鉴别掺伪麝香。
中药材2004,27
(1)8-10
6冯建跃等。
聚类分析法研究化妆品的真伪。
分析化学1996.24
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104-108
7陈桦等。
中国白酒香型的化学模式识别-主成分分析与因子分析食品科学2000,27
(1):
42-47
第二部分实验操作
一.实验目的
1、熟悉HS-GC-FID联用仪器的操作方法和实际样品分析方法的建立过程。
2、了解指纹图谱概念,学习快速建立各类木材指纹图谱的过程。
3、了解主成分分析原理与投影、模式识别与Excel中相关系数的计算方法。
4、学习化学计量学数据处理基础知识。
5、学习自主设计实验
二.仪器与试剂
1、仪器Varian3900气相色谱仪,瑞士CTC公司Combipal型带顶空装置的三合一自动进样器。
2、实验样品
木材类:
香樟、松树、银杏、梧桐等四种树或其树皮。
三.实验原理与技术
顶空气相色谱分析方法是通过测定样品上方气体成分来测定该组分在样品中的含量,其理论依据是在一定条件下气相和液相(固相)之间存在着分配平衡。
本实验体系中,各种木材所含的挥发性化学物质在性质和含量上都有差异。
当进行顶空气相色谱分析时,表现为各种木材树皮都具有自己特征的色谱流出曲线。
利用这种色谱流出曲线的特征性,经过适当的数据处理,就可以将同一分析方法下获得的各种木材的色谱特征图与标准库里谱图相匹配,根据不同的匹配度对不同木材进行模式识别。
本实验采用静态顶空气相色谱法,建立指纹图谱库所需的木材标准品来源于上海华东木材研究所,待检验样品为实验人员自带。
四.实验内容
1、色谱条件
(1)色谱柱:
VarianHPINNOWAX(30m×
0.25mm×
0.25um,固定相:
键合/交联聚乙醇,极性柱)
(2)柱温采用程序升温,升温程序见下表:
temp
rate
hold
total
60
0.5
80
10
3
130
1.5
21.17
200
18
25.56
(3)检测器温度:
260℃(4)进样口温度:
230℃
(5)分流比:
5:
1
2、顶空装置的参数设置
(1)进样体积:
400μL
(2)进样针温度:
110℃
(3)振荡器温度:
100℃(4)加热时间:
10min
(5)GC循环时间:
21min
3、实验步骤
(1)采集香樟、松树、银杏、梧桐等四种树的树皮样品各0.5克装入顶空瓶。
(2)开启HS-GC-FID等实验相关设备
(3)根据前期实验得到的优化结果设定实验色谱条件
(4)运行方法,分别测定各样品,各进样六针并采集各自的色谱数据,根据获得谱图数据进行数据处理。
五.数据处理
1参考实验原理部分的数据处理介绍。
理解色谱数据所代表的化学含义并尝试色谱数据预处理。
珊瑚
梧桐
香樟
t(min)
2
2.716
7713
6079
5845
4101
4000
4271
2.948
114129
109959
98509
2.986
149650
142645
149529
3.198
39733
37000
35316
3.252
91541
85609
87337
3.571
62897
88831
74065
3.913
62915
47011
58217
4.685
685847
708125
646049
4.902
4066
3518
3249
6576
5971
7000
5.232
77948
97626
64482
7.696
8168
8140
9005
7581
6876
7524
8.563
207224
206143
233391
8.724
10378
9699
10604
11749
11517
13022
8.771
63073
61990
64177
8.799
8038
8269
8941
8964
8265
8685
9.102
99253
83387
88163
9.649
37657
33871
35000
9.908
38799
34424
36000
9.977
83239
76955
78378
10.132
5599
5696
6735
7484
7551
7971
13.434
3320
2286
2868
3829
4593
2利用EXCEL计算各待检验样品与标准样品色谱峰面积之间的相关系数,初步实现分类识别。
1,2
1,3
2,3
相关系数
0.9932
0.9864
0.9974
0.9973
0.998
0.9968
0.9977
0.9959
3结合计算机色谱数据库中标准样品的色谱数据,利用METLAB等软件工具对各待检验样品的色谱数据进行主成分分析投影、聚类分析和模式识别。
从图中可以明显地看出1,2,3是一类,4,5,6为另一类,7,8,9又是一类。
六.注意事项
(1)本实验各条件参数必须与色谱库中标准样品实验条件一致。
(2)采集待检验样品时,需要采集尚在进行新陈代谢活动的树皮,为了使稍后的数据处理部分更科学,各待检验样本的质量应该相同。
(3)在数据处理时,需要视情况进行一定的数据预处理,比如对齐保留时间等。
七.思考题
(1)简单说明顶空气相色谱的特点及应用领域。
顶空气相色谱(GCheadspaceAnalysis)是指对液体或固体中的挥发性成分进行气相色谱分析的一种间接测定法,它是在热力学平衡的蒸气相与被分析样品同时存在于一个密闭系统中进行的。
这一方法从气相色谱仪角度讲,是一种进样系统,即“顶空进样系统”。
主要用于复杂基体中挥发性残留物的分析。
其做法是:
对与液体或固体试样达成热力学平衡的气相组分进行取样分析,从而测定待测样品中的分析组分。
顶空气相色谱法由于具有低检测限、快速简便,不需要样品前处理等特点,因而在食品卫生、环境保护、合成材料、生物化学等众多领域中得到广泛应用。
(2)通过文献查阅,解释指纹图谱概念和应用。
指纹图谱的建立应体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。
为此,才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化,从而便于推广和应用。
指纹图谱的建立主要是用于产品质量的评定,如中草药的指纹图谱;
也可用于刑侦,如DNA的指纹图谱。
(3)讨论主成分分析的基本步骤、意义和作用。
设法将原来变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量,同时根据实际需要从中可以取出几个较少的综合变量尽可能多地反映原来变量的信息的统计方法叫做主成分分析,也是数学上处理降维的一种方法。
基本步骤
1、原始指标数据的标准化采集p维随机向量x=(x1,X2,...,Xp)T)n个样品xi=(xi1,xi2,...,xip)T,i=1,2,…,n,
n>p,构造样本阵,对样本阵元进行如下标准化变换:
其中
,得标准化阵Z。
2、对标准化阵Z求相关系数矩阵
其中,
。
3、解样本相关矩阵R的特征方程
得p个特征根,确定主成分
按
确定m值,使信息的利用率达85%以上,对每个λj,j=1,2,...,m,解方程组Rb=λjb得单位特征向量
4、将标准化后的指标变量转换为主成分
U1称为第一主成分,U2称为第二主成分,…,Up称为第p主成分。
5、对m个主成分进行综合评价
对m个主成分进行加权求和,即得最终评价值,权数为每个主成分的方差贡献率。
概括起来说,主成分分析主要由以下几个方面的作用。
1.主成分分析能降低所研究的数据空间的维数。
即用研究m维的Y空间代替p维的X空间(m<p),而低维的Y空间代替高维的x空间所损失的信息很少。
即:
使只有一个主成分Yl(即m=1)时,这个Yl仍是使用全部X变量(p个)得到的。
例如要计算Yl的均值也得使用全部x的均值。
在所选的前m个主成分中,如果某个Xi的系数全部近似于零的话,就可以把这个Xi删除,这也是一种删除多余变量的方法。
2.有时可通过因子负荷aij的结论,弄清X变量间的某些关系。
3.多维数据的一种图形表示方法。
我们知道当维数大于3时便不能画出几何图形,多元统计研究的问题大都多于3个变量。
要把研究的问题用图形表示出来是不可能的。
然而,经过主成分分析后,我们可以选取前两个主成分或其中某两个主成分,根据主成分的得分,画出n个样品在二维平面上的分布况,由图形可直观地看出各样品在主分量中的地位,进而还可以对样本进行分类处理,可以由图形发现远离大多数样本点的离群点。
4.由主成分分析法构造回归模型。
即把各主成分作为新自变量代替原来自变量x做回归分析。
5.用主成分分析筛选回归变量。
回归变量的选择有着重的实际意义,为了使模型本身易于做结构分析、控制和预报,好从原始变量所构成的子集合中选择最佳变量,构成最佳变量集合。
用主成分分析筛选变量,可以用较少的计算量来选择量,获得选择最佳变量子集合的效果。
(4)什么是化学模式识别?
举例说明模式识别可以解决的实际问题。
模式识别可用于文字和语音识别、遥感和医学诊断等方面。
①文字识别
在信息技术及计算机技术日益普及的今天,如何将文字方便、快速地输入到计算机中已成为影响人机接口效率的一个重要瓶颈,也关系到计算机能否真正在我过得到普及的应用。
目前,汉字输入主要分为人工键盘输入和机器自动识别输入两种。
其中人工键入速度慢而且劳动强度大;
自动输入又分为汉字识别输入及语音识别输入。
从到目前为止,除了脱机手写体数字的识别已有实际应用外,汉字等文字的脱机手写体识别还处在实验室阶段。
② 语音识别
语音识别技术技术所涉及的领域包括:
信号处理、模式识别、概率论和信息论、发声机理和听觉机理、人工智能等等。
近年来,在生物识别技术领域中,声纹识别技术以其独特的方便性、经济性和准确性等优势受到世人瞩目,并日益成为人们日常生活和工作中重要且普及的安验证方式。
而且利用基因算法训练连续隐马尔柯夫模型的语音识别方法现已成为语音识别的主流技术,该方法在语音识别时识别速度较快,也有较高的识别率。
③指纹识别
我们手掌及其手指、脚、脚趾内侧表面的皮肤凹凸不平产生的纹路会形成各种各样的图案。
而这些皮肤的纹路在图案、断点和交叉点上各不相同,是唯一的。
依靠这种唯一性,就可以将一个人同他的指纹对应起来,通过比较他的指纹和预先保存的指纹进行比较,便可以验证他的真实身份。
一般的指纹分成有以下几个大的类别:
环型(loop),螺旋型(whorl),弓型(arch),这样就可以将每个人的指纹分别归类,进行检索。
指纹识别基本上可分成:
预处理、特征选择和模式分类几个大的步骤。
③遥感
遥感图像识别已广泛用于农作物估产、资源勘察、气象预报和军事侦察等。
④ 医学诊断
在癌细胞检测、X射线照片分析、血液化验、染色体分析、心电图诊断和脑电图诊断等方面,模式识别已取得了成效。
(5)结合自己的实验过程谈谈实验体会。
在老师把各项参数都调好并给我们操作后,貌似实验挺简单的。
但是自己做的话就会遇到各种各样的问题,比如测的样品应该在什么样的升温程序下会得到比较好的峰形与峰距,还有如何开机关机以及具体如何操作等。
这都必须自己动手实践后才能真正掌握。
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