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放射性标记的单链DNA片段还用另外3种不同的化学降解法处理,在核苷酸链的其它3个碱基(C,A,G)处随机切断。
然后各个处理所产生的DNA随机片段混合物分别用同一凝胶进行电泳。
因为DNA长度不同,移动的距离不同,长度短的,移动速度快,甚而只有一个碱基之差也可鉴别,所以从底部开始依次读取,就可得出片段的碱基顺序(11-44)。
进行这样的工作,最合适的材料要数很小的RNA噬菌体MS2,它的RNA不仅是遗传物质,而且同时还是mRNA。
MS2的RNA很容易在E.coli细胞中复制,而且RNA分子很小,仅有3569个碱基,含有3个基因,分别编码“A”蛋白,外壳蛋白和RNA复制酶。
当MS2侵染雄性E.coli时,一个早期基因——RNA复制酶基因先合成复制蛋白。
这蛋白与细菌细胞中某些蛋白质组合,形成一种复合酶,催化合成很多RNA分子。
随后两个晚期基因启动,合成“A”蛋白和外壳蛋白。
这些蛋白质与RNA联合,装配为成熟的病毒粒子而释放出去。
在说明了MS2的遗传组成后,我们可来考察基因与多肽间的共线性(colinearity)了。
Fiers等经过多年工作,于1972年5月报道了MS2的整个外壳蛋白基因的碱基顺序,随后他们就测定整个RNA分子的核苷酸顺序。
现在把MS2的一部分核苷酸顺序和一部分有关的氨基酸顺序并列起来,使我们可以在分子水平上对基因的本质有进一步的认识(图11-45)。
从图中可以看到:
(1)RNA的核苷酸顺序和蛋白质的氨基酸顺序完全可以对应起来。
例如外壳蛋白有129个氨基酸,与这129个氨基酸相对应的129个密码子就是一个外壳蛋白基因。
(2)基因的起始密码子是AUG,而终止密码子是UAA、UAG和UGA。
(3)基因与基因间有基因间区域(intergenicregion)。
进入70年代,基因操作技术发展起来,以前难以分析的高等生物的基因也可以分析了。
结果,原核生物中未见到过的新现象发现了,基因概念进一步发展了。
在一条DNA链上,从密码子ATG开始到终止密码子为止的连续核苷酸密码序列称为通读框(openreadingframe)。
细菌、病毒等的阅读框是连续的,其中核苷酸顺序都转译为蛋白质;
但在真核类中,几乎所有基因内部都含有不转译部分,在转录为初级RNA转录物时(或后),这一部分序列被切除,从而不转译为蛋白质。
基因的转译部分为外显子(exon或extron),不转译部分为内含子(intron或间插顺序interveningsequence)。
真核类基因的编码顺序由若干非编码区域隔开,使阅读框不连续,这种基因称为隔裂基因(splitgene)。
例如人的血红蛋白分子有4条多肽链,其中2条α链,各有141个氨基酸,2条β链,各有146个氨基酸。
这两种肽链分别由α基因和β基因编码。
α基因和β基因各有3个外显子和2个内含子(图11-46)。
有的基因含有的内含子可以高达数十个。
例如已知人的视网膜母细胞瘤(Retinobeastoma,Rb)基因长达200kbp(kilohasepair,千碱基对),含有26个内含子。
但高等生物的基因中也有不具有内含子的,如组蛋白基因等,但为数甚少。
据研究,内含子的突变率比外显子高。
这可能表明非编码的内含子DNA更易发生突变而不受选择上的限制,从而更有利于形成进化上有用的新基因。
上面已谈到过,Sanger在核酸测序方面作出了杰出的贡献,他和他的同事们在1977年还测定了噬菌体φX174DNA的全顺序。
这种噬菌体是单链环状DNA分子,它含有的碱基数还不到5400个,可是却要编码9种蛋白质,这是一个令人感到迷惑不解的事。
根据φX174DNA编码的9种蛋白质的分子量,可以估计出编码这些蛋白质所要的核苷酸数。
得出的核苷酸数明显地超出φX174DNA分子所能容纳的数量。
但在其核苷酸全顺序测定以后,这个看似矛盾的问题立即迎刃而解了。
φX174的一种蛋白质的编码顺序内可以存在着另一种蛋白质的遗传信息。
这就是重叠基因(overlappinggenes),是在φX174中首次发现的。
这儿应当指出,用两个不同阅读框编码两种不同的蛋白质,只是表明基因是重叠的,但每一阅读框的密码子还是不重叠的。
图11-47表示D基因和E基因的阅读框是重叠的,所以它们是重叠基因。
重叠基因发现在病毒中,看来这是节约空间的一个方法。
但在这种场合,一个碱基的改变可能会影响有关的两个重叠基因,所以可能由此受到严格的限制。
上面说明,基因可以是隔裂的,基因与基因也可以是重叠的,但不论怎样,在以DNA(或RNA)为遗传物质的生命体中,基因是DNA(或RNA)链的一个区段,并与它所决定的蛋白质的氨基酸顺序相对应,所以基因的3个基本特性可以从DNA分子的特性来加以说明。
(1)基因的自体复制DNA分子自体催化时,从一个DNA分子复制为全同的两个DNA分子,所以细胞分裂时,从一个基因自体复制为全同的两个基因。
(2)基因决定性状DNA分子异体催化时,某一区段的核苷酸顺序互补地决定mRNA的核苷酸顺序,转而专一性地决定蛋白质的氨基酸顺序。
所以某一基因存在时,决定某种酶或其它蛋白质的合成,从而通过生理生化过程,出现某一性状。
(3)基因的突变DNA分子很稳定,但偶而也会出现差错,例如某一区段内一个核苷酸对改变了。
改变了的新核苷酸顺序通过复制又能稳定地保持下去。
基因也很稳定,但偶而也会发生一个突变,出现一个跟原来的基因不同的新等位基因。
这基因通过自体复制又稳定地一代代传下去。
Cot曲线和重复顺序从细胞提取DNA,剪切成小片段,加热,使双螺旋分开成为单链,然后冷却到25℃,这时许多互补链将重新联结,或复性。
复性速率(reassociationrate)可用几种方法测定,其中一个方法是应用分光光度计,在260nm波段测量光密度的变化。
因为随着单链的复性成为双链,紫外光的吸收逐渐减少。
DNA复性速率与基因组中碱基顺序的复杂情况和重复程度有关。
顺序单调、重复程度高的DNA区段,例如顺序为ATATAT的高度重复顺序(highlyrepetitivesequence),与顺序变化大、重复程度低的DNA片段、例如单拷贝的结构基因(structuralgene)相比,前者的复性速率要明显地高于后者。
还有,复性速率也受到反应液中DNA初始浓度的影响:
浓度越高,互补链的碰撞机会越多,复性速率越快。
因此,以未复性的单链百分数为纵轴,初始浓度(Co)×
时间(t)为横轴,作成Cot复性曲线,可以用来估计重复顺序和单拷贝顺序的相对比例。
图11-48比较了原核生物和真核生物的Cot复性曲线。
从实验知道,E.coliDNA没有重复顺序。
在反应的起始阶段全都是单链,到最后阶段都成为双链,所以E.coli的复性曲线可以看作为是一条理想曲线。
但小牛DNA的复性曲线明显有异于E.coli:
前面一段曲线表明,小牛DNA片段的顺序短,重复程度高,所以复性速率明显高于E.coli;
后面一段曲线与单拷贝顺序有关,复性速率大大低于E.coli,因为小牛基因组中单一顺序远比E.coli复杂之故。
根据这类复性研究,知道重复顺序是真核生物DNA区别于原核生物DNA的一个重要特征。
真核类DNA的重复程度大致有下列3种(表11-8):
高度重复顺序主要存在于异染色质区域(heterochromaticregion),如存在于着丝粒近旁和核仁组成中心等处。
生化突变型与-基因-酶说基因的作用是决定某种酶或其它蛋白质的合成,从而通过生理生化过程,出现某一性状。
如果某一基因发生了突变,不能形成某种酶,或形成的酶的活性改变了,就出现生化突变型。
例如链孢霉的野生型或原养型是能合成泛酸的,有关的基因突变后,不再能合成泛酸,这就是一种生化突变型。
要这种生化突变型能够生长,也就是要这种泛酸依赖型能够生长,一定要在基本培养基(含有糖,氮源,如硝酸铵、酒石酸铵,某些无机酸、无机盐,一种维生素、即生活素)上添加泛酸后才能生长,而未突变前的野生型是能在基本培养基上生长的。
我们现在再举一个链孢霉的生化突变型的例子
链孢霉有很多精氨酸依赖型,已知是由几个非等位的基因控制的。
根据生物化学观点,在哺乳动物的肝中,精氨酸是通过下列步骤合成的:
前体→鸟氨酸→瓜氨酸→精氨酸
现在我们可以利用链孢霉的精氨酸依赖型来检验上面的假说(图11-49)。
在基本培养基上分别添加鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸,看不同菌株能否生长,结果如下表:
这些结果表明:
菌株Ⅲ:
自前体到鸟氨酸的反应受阻。
菌株Ⅱ:
自鸟氨酸到瓜氨酸的反应受阻。
菌株Ⅰ:
自瓜氨酸到精氨酸的反应受阻。
概括起来:
换句话说,基因arg1突变后,不能由前体转变成鸟氨酸,但鸟氨酸以后的化学反应能正常地进行,所以不仅供应精氨酸后能生长,而且供应鸟氨酸或瓜氨酸后也能生长。
基因arg2突变后,不能由鸟氨酸转变为瓜氨酸,但瓜氨酸转变为精氨酸的化学反应可照常进行,所以供应瓜氨酸或精氨酸都能生长。
基因arg3突变后,不能由瓜氨酸转变为精氨酸,所以只有供应精氨酸才能生长。
那末基因如何控制生化反应呢?
已有的研究结果清楚地表明:
基因决定酶的形成,酶控制生化反应,从而控制代谢。
这就是一基因一酶说(one-gene-one-enzymetheory)。
根据这个学说,链孢霉中精氨酸合成过程可以写成下面的样子:
人的先天代谢缺陷人体中苯丙氨酸的代谢有几条路线(图11-50)。
某些苯丙氨酸构成我们身体的蛋白质,某些苯丙氨酸转变为酪氨酸,最后成为黑色素。
某些酪氨酸构成我们身体的蛋白质,某些酪氨酸上的氨基为一个氧原子所代替,氧化成为对羟苯丙酮酸,于是通过尿黑酸,乙酰醋酸而逐步降解为CO2和水。
其中每一步都需要特定的酶,这些酶在正常人体中都能产生的。
但人类中有一种先天代谢病,叫做黑尿病(alcaptonuria)。
这种病人看来没有什么不健康,不过他们的尿液在空气中放置一段时间会变黑,而正常人的尿液不会变黑。
尿液中变黑的东西是尿黑酸,尿黑酸是无色的,但在空气中氧化后就变黑色。
正常人的血液中有一种尿黑酸氧化酶(homogentisicacidoxidase),能把尿黑酸变成乙酰醋酸,最后分解成C02和水。
黑尿病病人不能形成尿黑酸氧化酶,因此尿黑酸不能进一步转变,就直接在尿液中排泄出来。
如果把黑尿病基因写作a,那末黑尿病病人的基因型是aa,正常人的基因型是AA或Aa,那就是说,一定要有A基因才能形成尿黑酸氧化酶,才能不患黑尿病。
白化病(albinism)也由于同样的原因。
白化病患者不能形成黑色素或几乎不能形成黑色素。
全白化的人皮肤很白,带粉红色,头发淡黄色,眼睛的虹彩粉红色,怕光,视力也差些。
上面已谈到,黑色素的前体是酪氨酸,酪氨酸经过酪氨酸酶(tyrosinase)的作用成为双羟苯丙氨酸,然后再通过酪氨酸酶系的作用,最后形成黑色素。
白化病患者不能显示出酪氨酸酶的作用。
如果我们把决定酪氨酸酶的基因称为C,则正常人的基因型是CC或Cc,而白化病的人是cc,因为白化病的人没有C基因,就没有酪氨酸酶,不能形成黑色素。
还有苯酮尿症(phenylketonuria)患者也是由于一个隐性基因引起的。
pp个体不能形成苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase),不能把苯丙氨酸转变为酪氨酸,所以血液中苯丙氨酸累积起来,进一步引起下列变化:
(1)过量的苯丙氨酸损害中枢神经系统,影响智力发育。
(2)苯丙氨酸不能变成酪氨酸,只能通过苯丙氨酸转氨酶的作用,变为苯丙酮酸,在小便中排出,所以叫做苯酮尿症。
(3)血液中苯丙氨酸太多,抑制酪氨酸代谢,抑制酪氨酸变成黑色素,皮肤中的黑色素特别少,所以患者的肤色和发色很浅。
既然苯酮尿症是由苯丙氨酸过量引起的,那么可否从食物中除去苯丙氨酸呢?
但是苯丙氨酸是必需氨基酸之一,是构成蛋白质的一种原料,而人又是苯丙氨酸依赖型,自己不能制造,必须由食物供应。
不过一般饮食中所供应的苯丙氨酸往往过量,所以如能在婴儿期及早诊断明确,控制食物中的苯丙氨酸的分量,这样就不会过量,因而可以防止对中枢神经系统的损害。
这是遗传病可以防治的一个例子。
不仅氨基酸代谢的反应链会受到阻碍,脂肪和糖类代谢也可由于缺乏适当的酶而受到阻碍。
例如极少数婴孩不能利用半乳糖,所以不能喂以人奶和牛奶,因为奶中含有乳糖,乳糖分解后会产生半乳糖。
如果喂以奶类,血中半乳糖水平显著升高,随后排出于尿中。
临床症状一般很严重,呕吐和腹泻,肝脏逐渐肿大,眼内障,生长延缓,智能低下,往往在婴儿期死亡。
如这种婴儿的食物中完全没有乳糖和半乳糖,血中半乳糖水平很快低下,健康状况大大改进。
如发现得早,食物中不含有半乳糖,则生长发育可以相当正常。
如治疗稍迟,肝脏已某种程度受损,眼内障,智能低,一生如此,不能恢复。
不能同化半乳糖的病,叫做半乳糖血症(galactosemia),是由罕见的常染色体隐性基因决定的。
下面的一个家系就可用这样的遗传方式来说明(图11-51)。
半乳糖在身体中形成半乳糖脂,是构成神经系统的重要原料,又像其它糖类一样,作为能量的来源,把半乳糖导入糖类的通常代谢途径中,所以半乳糖必须先转变为葡萄糖衍生物,它的代谢途径如下:
+ADP(二磷酸腺苷)
尿苷二磷酸半乳糖+1-磷酸葡萄糖
那末半乳糖血症的人究竟缺少那种酶,使半乳糖的代谢受阻呢?
下面是对几种人的分析结果。
从上表可以看到,半乳糖激酶和异构酶的活性在正常人和患者中是相同的,但转移酶的活性在3种人中差异很大,正常人最高,患者最低,而杂合体约为正常人的一半。
因为患者的转移酶活性很低,所以1-磷酸半乳糖很少转变为1-磷酸葡萄糖,1-磷酸半乳糖就堆积起来,抑制了磷酸葡萄糖变位酶的作用,使它所酶促的
的反应受阻。
这样半乳糖积聚,葡萄糖代谢受阻,所以半乳糖血症患者就出现上述各种严重症状。
上面所讲的先天代谢缺陷都是由于一种酶的缺失,由一隐性基因所控制,所以都是说明基因的作用是决定某种酶,从而通过代谢途径,控制某一性状。
基因的精细结构以前几章的说明,引导我们相信,基因在染色体上以线性方式排列着,很有点像念珠,所以这个观点可以称作念珠学说(beadtheory)。
关于这个学说,有几点值得提出来探讨。
①基因是结构单位,不能由交换分开。
交换只能发生在基因之间,而不在它们之中。
②基因是突变单位。
基因可以从一个等位形式变为另一等位形式,但在基因内部没有可以改变的更小单位。
③基因是作用单位,能产生一种特定的表型效应。
基因的部分,如果有的话,不能起作用。
④染色体是基因的载体。
染色体的存在,使等位基因可以有规则分离,又可使非等位基因间相互重组。
我们在这一节里要介绍一些实验,说明基因的精细结构,同时使我们对基因的本质可有进一步的了解。
(1)位置效应果蝇中,棒眼性状的遗传方式是X连锁显性,它是由X染色体的微小重复引起。
突变体的复眼数减少,复眼象棒状,所以有这个名称(图9-8,11-52)。
从唾腺染色体来看,X染色体有一“16A”区域。
这区域重复,有相邻的两份时,出现棒眼性状。
如果这个区域回复为一份时,复眼正常,而这区域增至三份时,出现重棒眼性状(见图9-8)。
Sturtevant通过杂交,得到各种基因型,其中棒眼(B)、重棒眼(BB)和野生型(+)以各种方式组合起来。
他为了了解各种基因型的复眼的大小,计算复眼中的小眼数,结果见表11-11。
Sturtevant根据这个结果,最早注意到,棒眼基因(B)不是完全显性,棒眼杂合体(+/B)的小眼数比纯合体(B/B)多得多;
而特别观察到,位置的不同,对表型有显著影响。
例如B/B个体和BB/+个体都有4个“16A”区域,可是小眼数不同,这叫做位置效应(positioneffect)。
我们看,在+/BB个体中,两个B在同一染色体上,借用化学上的术语,说是处于顺式(cis)位置,对小眼数的影响大些,而在B/B个体中,两个B在不同染色体上,称为反式(trans)位置,对小眼数的影响要小一些。
这说明“16A”区域在染色体上的排列,影响到最后的表型。
可见基因的近邻是重要的,基因在染色体上的位置有功能上的意义。
(2)顺反子曲霉菌Aspergillusnidulans的菌丝是单倍体。
菌丝的顶部形成一连串的细胞,叫做分生孢子(conidia)。
孢子萌发,又长成菌丝。
如果把两个单倍体菌株混合培养,有时不同菌株的菌丝互相融合,使两种不同的核处于同一细胞质中。
这种情况叫做异核体(heterokaryon)。
在异核体中,两个核偶而会发生融合,形成二倍体核。
它们的菌丝产生二倍体分生孢子。
这种孢子就可分离出来,长成二倍体菌落,进行遗传学分析。
在曲霉菌中,曾经发现许多需要腺嘌呤的营养缺陷型,要在培养基上加些腺嘌呤才能生长。
其中有两个缺陷型ad16和ad8是在第一染色体上。
这两缺陷型的杂合体仍旧是缺陷型,这表明ad16和ad8是等位的。
可是它们的后代中大约出现0.14%的野生型,这又表明ad16和ad8不是在同一染色体的同一位置上,两者之间可以发生交换。
因为这交换不是发生在减数分裂中,而是出现在二倍体菌丝的有丝分裂中,所以叫做体细胞交换(somaticcrossingover)或有丝分裂交换(mitoticcrossingover)。
我们现在把体细胞交换的过程和所得的结果图示如下(图11-53):
杂合体
(2)和(4)是野生型,这表明ad16和ad8都是隐性的。
杂合体
(1)是突变型,当然也很容易理解,可是把(3)和(4)相比,两者的基因型相同,单是排列不同,为什么顺式排列(ad16ad8/++)是野生型,而反式排列(ad16+/+ad8)是突变型呢?
顺式杂合体(4)是野生型,而反式杂合体(3)是突变型,顺式和反式的表型效应不同,似乎很难理解。
这是因为我们把ad16和ad8分别来考虑,把它们看作是两个座位(loci)或基因,认为ad16/+的表型应该是野生型,ad8/+的表型也应该是野生型,现在反式杂合体(3)是突变型,就不好理解。
但是如果把ad16和ad8看作是一个作用单位——顺反子(cistron)——中的两个位点(sites),那末这个现象就容易说明(图11-54)。
在顺式杂合子(4)中,一个顺反子的两个位点都发生突变,而另一顺反子正常,所以杂合体的表型是野生型。
而在反式杂合体(3)中,两个顺反子各有一个位点发生突变,没有一个顺反子具有形成正常表型所需的遗传信息,所以它的表型是突变型。
根据上面的顺反试验(cis-transtest),我们可以这样说,如果把作用单位——顺反子看作一个基因,那么基因内的不同位点上可以发生突变,基因内的不同位点间可以发生重组。
(3)互补试验噬菌体T4感染E.coli,引起溶菌。
有一组T4突变型,产生大而边缘清楚的噬菌斑,叫做快速溶菌(rapidlysis,r),而野生型噬菌体的噬菌斑小而边缘模糊。
噬菌体染色体的好几个不同座位都可发生突变,引起速溶。
Benzer对一组叫做rⅡ的速溶突变型进行详细而深入的研究。
突变型rⅡ能在E.coli菌株B上生长,形成大而清楚的噬菌斑,但全然不能在E.coli菌株K(λ)上生长,这儿K(λ)表示这菌株带有噬菌体λ,是溶源菌。
另一方面,野生型rⅡ+在菌株B和K(λ)上都能生长,形成小而模糊的噬菌斑。
从而它们的关系是这样的:
因为rⅡ的生长是有条件的,所以可用选择技术,把重组子检出。
Benzer把rⅡ突变型一对对地进行杂交,测量每对突变位点(mutationalsites)间的重组频率。
方法是这样的:
把每对rⅡ突变型品系对E.coliB进行复感染(doubleinfection)。
感染一定要同时进行,否则要出现排斥现象,超感染(superinfection)的噬菌体很快地被宿主的DNA酶破坏,因而不能参加重组。
形成噬菌斑后,收集溶菌液——子代噬菌体。
把溶菌液接种在E.coliB上,估计溶菌液中的病毒数,因为两个rⅡ突变型和重组子r+(或rⅡ+)都能生长;
而把溶菌液接种在E.coliK(λ)上,估计野生型重组子(r+)数,因为只有r+重组子能够生长(图11-55)。
而双突变型重组子(rxry)不能检出,所以我们估计总重组子的最好方法是,把r+重组子的数目乘以2。
这样我们就可用下列公式计算重组值。
现举例说明计算方法。
两突变型rx与ry杂交,将溶菌液稀释为10-6,取其0.1ml涂布在B株上,生成的噬菌斑数为525,又将溶菌液稀释为10-2,取其0.1ml,接种于K(λ)株上,得噬菌斑数为370,则这两突变位点间的重组率为
应用上述方法,即使低到0.0001%的重组率也可简单而正确的检出。
根据很多二点杂交(two-pointcrosses)的结果,可以作一连锁图(图11-56)。
从图上可以看到,图距基本上是相加的。
例如r47与r104间的图距是1.3,r104与r101间的图距是1.0,而位于两边的r47与r101间的图距是2.2,很接近1.3与1.0之和。
Benzer又注意到,rⅡ突变型可以分成两组,A和B。
A组的一个突变型和B组的一个突变型同时感染E.coliK,可以互补。
所谓互补(complementation),就是两个突变型同时感染E.coliK时,可以互相弥补对方的缺陷,共同在菌体内增殖,引起溶菌,释放原来的两个突变型。
可是A组内的两个突变型,或B组内的两个突变型不能互补。
可见A组的一个功能有缺陷,可为B组所补偿;
而B组的一个功能有缺陷可为A组所补偿(图11-57)。
很有意义的事是,试验结果,所有A组突变型都在rⅡ区域的一边,是一个作用单位,所有B组突变型都在rⅡ区域的另一边,是另一个作用单位,所以rⅡ区域包括两个顺反子。
一旦我们接受基因是一个作用单位,我们就可应用互补试验来确定有同一表型效应的两个突变型是等位的,还是非等位的(图11-58)。
详
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