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2.1植物酯酶
2.1.1植物酶法快速检测有机磷农药残留的原理
酶法快速检测有机磷农药的技术近年来发展很快具有快速方便灵敏度高等优点植物酯酶水解底物α-乙酸萘酯生成乙酸和α-萘酚,α-萘酚与固蓝β盐作用生成紫红色的偶氮化合物当酶受到有机磷农药的抑制后影响显色反应因此可根据产生的显色反应强弱指示农药残留情况[3]:
2.1.2酶源的选择
酶源的选择是生物酶技术应用的基础酶源的筛选。
主要依据对有机磷农药的敏感性而定。
而且要来源丰富价廉易得。
黄保宏等[4]研究了不同植物在种子和幼苗时期的植物酯酶的含量,结果表明以内乡188幼苗小麦酯酶含量最为丰富。
肖建军等[5]以乐果为抑制剂对各种小麦酯酶进行了筛选所研究的小麦品种中豫麦39和小麦周9的敏感性最强。
近年来许多研究者在玉米大米小麦和面粉酶源中进行了植物酯酶的研究发现面粉酶对农药较为敏感由此开展了大量的以面粉酶为酶源的农药残留研究[6]。
2.1.3植物酯酶抑制法的优点
(1)酶源易得提取和保存较为方便。
酶法快速检测农药残留的方法中多采用敏感家蝇头部获得的乙酰胆碱酯酶[5]但是动物酯酶常常表现为保持期短需冷冻低温保存而植物酯酶酶源丰富只需以一定比例的水或缓冲液混合离心获得的上清液即可作为粗酶液在-4℃保存。
(2)测量准确度和精密度均较好
王仲海等[7]对植物酯酶和动物酯酶在不同pH值下的酶活抑制程度等性质进行了试验结果表明动物酯酶中的苍蝇酶蝇蛆酶与植物酯酶中的小麦酯酶相比其活力和被农药抑制程度处于相近的水平黄志恿等[8]比较了面粉酯酶和动物来源的乙酰胆碱酯酶对4种有机磷农药残留的快速检测通过加标回收率试验得出了两种酶抑制法的测量准确度相当植物酯酶法测量的精密度较高的结论。
(3)检测时间短,成本低
在常规的农药残留的检测中仪器分析法是常采用的标准方法如气相色谱和液相色谱这些方法的检测结果准确灵敏度高但需要配备昂贵的仪器设备而且需要训练有素的专业技术人员操作无法适应我国即采即销的产销方式。
为此酶法检测农药残留由于前处理简单检测时间短所需仪器设备简单可对市场上含残毒的蔬菜进行监控及时排除超标蔬菜在市场上的交易韩承辉等[9]研制的植物酯酶片对有机磷农药的测定成本仅为0.1元。
2.1.4存在问题以及解决方法
由于酶是一种生物活性物质在液体状态下保存极易导致酶失活或引起酶的变性。
而研究人员通过液氮处理或将酶制作成酶片从而保证酶的活性,也可以用酶的固定化解决该问题。
总之,利用植物酯酶抑制法快速检测农药残留技术在时间成本速度等方面都比传统的仪器分析方法具有明显的优势近几年在我国推广很快但是不同的植物酯酶对有机磷农药的抑制强度不同应采取适当的分离提取方法对其结构进行研究明确作用靶标部位以期更有效地提高植物酯酶的检测灵敏度。
2.2乙酰胆碱酯酶与鸡肝酯酶的比较
目前,有关快速检测农药残留的报道,大部分是通过酶抑制法来实现的。
所使用的酶主要为乙酰胆碱酯酶,检测手段是以测定乙酰胆碱酯酶活力被抑制的程度来判断农药残留是否超标。
通过测定有机磷农药作用下的乙酰胆碱酯酶活力和总酯酶活力,比较乙酰胆碱酯酶和鸡肝酯酶的优劣。
2.2.1酶活检测
检测方法见文献[7],主要是测定四种农药(敌敌畏、敌百虫、马拉硫磷和西维因)对这两种酶的乙酰胆碱酯酶活力和总酯酶活力的抑制情况。
由于鸡肝酯酶没有乙酰胆碱酯酶活性,所以农药对鸡肝酶中乙酰胆碱酯酶活力的抑制未进行测定。
结果可以清楚地发现除马拉硫磷外,鸡肝中总酯酶活力对其余3种农药的检出限都较乙酰胆碱酯酶低。
这可能与动物肝脏本身还含有其它酶系有关,它们会促进农药对酯酶的抑制,结果在检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药时有较低的浓度检出限。
鸡肝粗酶液中缺乏乙酰胆碱酯酶活力,也说明有机磷和氨基甲酸酯类农药在生物体中不仅仅抑制乙酰胆碱酯酶活力,而且对属于酯酶B中的其它酯酶也能进行抑制。
2.2.2不同酶活对4种农药的灵敏度
不管采用α-乙酸萘酯作为底物,还是采用硫代乙酰胆碱作为底物,所测酶活对农药的灵敏度都可以通过K′进行比较。
K′越大,说明该酶活对农药的浓度变化越敏感。
K′由以上测定的酶活力转化,得到如下图表:
由表1可以看出,采用α-乙酸萘酯作为底物,乙酰胆碱酯酶表现出的酶活对4种农药的灵敏度皆高于鸡肝中的总酯酶活力;
但采用硫代乙酰胆碱作为底物,乙酰胆碱酯酶活力对4种农药的灵敏度与鸡肝中总酯酶活力的灵敏度相近。
2.2.3鸡肝酯酶检测范围
2.3酶的选择总结
然而,这种方法存在一些不足。
首先,所用酶(乙酰胆碱酯酶)价格昂贵;
其次,由于是在体外进行抑制,某些农药对乙酰胆碱酯酶的抑制并不明显。
因此,有人认为对此需要附加氧化助剂,以提高对农药检测的灵敏度[10]。
同时,有人利用植物来源或动物来源(肝脏、血液等)的酯酶粗酶液,通过测定总酯酶活力的抑制程度对有机磷农药和氨基甲酸酯类农药进行检测[10,11]。
多数研究结果表明,如果没有辅助性氧化作用,植物酯酶仅对有机磷类个别农药(如敌敌畏)有较明显的的抑制响应[11]
通过4种农药对两种酯酶的(以α-乙酸萘酯作为底物时的)总酯酶活力和(以硫代乙酰胆碱作为底物时的)乙酰胆碱酯酶活力的抑制灵敏度比较,发现鸡肝总酯酶活力与电鳗乙酰胆碱酯酶活力有相近的受农药抑制的灵敏度,并且鸡肝总酯酶活力在检测农残时,可获得更低的农药含量检出限,除马拉硫磷外均低于国家规定的最大农药残留限量标准(见表2)。
因此,以测总酯酶活力的方法替代测乙酰胆碱酯酶活力的方法,同样可以达到快速检测农药残留的目的,而且鸡肝酶具有提取简便、价格低廉的优点。
因此鸡肝酯酶是一种作为有机磷农药检测的理想酶。
当然对于其本身的研究目前还是不够深入。
对于该酶的纯化以及动力学的研究需要去进一步的去做,探索是否有相关的替代酶。
3.酶的分离与纯化
生命体在代谢过程中会产生酶,几乎所有生命体的化学反应都是在酶的参与下进行的。
酶具有专一性强,催化效率高和反应条件温和等众多优点,其已经成功的应用于食品、化工、医药、能源,环保和科研等领域。
酶的提取和纯化,不仅是生产的需要也是酶学研究中必不可少的过程。
除了核酶以外几乎所有的酶其化学本质都是蛋白质,因此酶的分离纯化过程实质就是对目标蛋白质和杂蛋白的分离纯化过程,只是更加关注酶的稳定性而已。
与其他物质的分离纯化过程相同,要想实现对蛋白与杂质成分的成功分离,首先应允分了解蛋白质和杂质的理化性质,尤其是目标蛋白质的性质,比如组成成分(元素和基团)、溶解性(亲水还是疏水)、分子大小、等电点(在不同pH下的解离状态)以及稳定性等基本性质。
之后才能选择恰当的分离方法,产生预想的效果。
总的来说酶分离纯化过程大致包括3个阶段:
酶释放和粗分离过程、进一步提取提纯过程和最后的精致纯化过程。
3.1酶分离纯化应注意的问题
根据酶本身的特性,在分离纯化工作中必须注意下列问题:
a)要注意防止酶的变性失活.
b)酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去,因此,在不破坏所需酶的条件下,可使用各种“激烈”的手段。
此外,由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性,当这些物质存在时.酶的理化性质和稳定性发生了一定变化,从而提供了更多条件和方法可供采用。
c)酶具有催化活性。
检测酶活性,跟踪酶的来龙去脉,为选择适当方法和条件提供直接依据。
在工作过程中,从原料开始每步都必须检测酶活性.一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大,活力回收高,同时重复性好。
由此,酶的分离纯化一般包括一下几个基本环节:
①抽提,即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液;
②纯化,即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来;
③制剂,即将酶制成各种剂型。
3.2预处理及固液分离技术
3.2.1细胞破碎(celldisruption)
a)高压均质器法:
此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。
将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中,菌体从高压环境转到低压环境,细胞就容易破碎。
菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。
细胞破碎率与细胞的种类有关。
要达到90%以上的细胞破碎率,起码要将菌悬液通过均质器两次。
最好是提高操作压力,减少操作次数。
但有人报道,当操作压力达到175Mpa时,破碎率可达100%。
当压力超过70Mpa时,细胞破碎率上升较为缓慢。
高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素[12]。
丝状菌会堵塞均质器的阀门,尤其高浓度菌体时更是如此。
在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。
b)容菌酶处理法:
蛋清中含有丰富的溶菌酶,价格便宜,常用来裂解细胞。
具体做法是:
溶壁微球菌(micrococcuslysodeikticus)43kg,置于0.5%的氯化钠溶液中,使细胞浓度为5%(干重),在35℃用0.68kg(干重)的蛋清处理20min,得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理,用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去,再将乙醇浓度提高到75%(体积分数),可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。
3.2.2离心
离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型,所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。
过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔,壁上有过滤介质,一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。
沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离,如发酵液中的菌体,用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。
分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。
3.2.3膜分离技术
在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。
在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜,使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜,而大分子被截留于膜表面。
大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。
功能膜决定了膜的孔径,而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。
超滤浓缩的优点是:
操作条件温和,无相变化,对生物活性物质没有破坏。
超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成,料液经泵打入超滤器,水及低分子量物质排出超滤器外,被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。
当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。
超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题:
第一,在超滤循环过程中,由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用,料液的温度会逐渐升高,会造成蛋白质分子的损失。
因此,料液贮罐应加冷却系统,并安装自动测温及控制系统。
第二,某些酶的辅助因子散失为问题:
一些酶含有辅助因子,其分子量小,超滤时易从透过液中排除掉,因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的辅助因子。
还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。
其工作原理是:
当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时,如果在膜的一侧结合着亲和配基,该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。
不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。
再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来,洗脱液用于进一步的分离纯化。
Krause[13]等从大肠杆菌培养液中纯化苹果酸脱氢酶的研究中指出,经3次此方法操作,苹果酸脱氢酶的纯化比可达到200倍.回收率超过90%,其可以作为精制纯化产品应用。
3.2.4泡沫分离
原理:
将气体通入含多种组分的溶液中,由于这些组分的表面活性由差异,因此在溶液的表面,某些组分将形成泡沫,泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。
泡沫中含有更多的表面活性成分,故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。
这样,溶液中的组分就得以分离。
蛋白质较易吸附与气液界面,这有利于其结构的稳定。
泡沫分离过程是:
蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面,该过程可能是可逆的也可能是不可逆的;
分子发生重排,一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜,一种是稀膜,另一种是浓膜,可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。
在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。
膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。
泡沫分离的目的,一方面提高酶蛋白的富集率(泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度),另一方面提高酶蛋白的提取率(泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量),或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。
3.3抽提
3.3.1盐析
常用的盐析剂是硫酸铵,其溶解度大、价格便宜。
硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强,其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。
对酶没有破坏作用。
pH的控制:
应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑,在酶等电点时其溶解度最小易沉淀,但有些酶再等电点时稳定性较差,因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。
在操作中一旦确定最佳pH值后,在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值,要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。
在添加硫酸铵时要注意搅拌,并注意硫酸铵的加入速度,一般是由少到多,缓慢加入,硫酸铵尽可能磨成细粉。
温度的控制:
有些酶在较高温度下稳定性能较好,可在常温下进行盐析操作,而对于大多数酶,尽可能在低温下操作。
酶液的净置:
加完硫酸铵后,酶液要静置一段时间,使酶蛋白完全沉淀下来,酶静置后,就不要再加以搅拌。
3.3.2有机溶剂沉淀
有机溶剂选择:
可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等,如甲醇、乙醇、异丙醇。
乙醇的亲水性能较好,可防止蛋白质的变性,酶蛋白在其中的溶解度也较低[14]。
有机溶剂沉淀操作:
有机溶剂一般都使蛋白质变性,当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。
因此用有机溶剂处理时最好在0℃以下进行。
用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久,要尽快加水溶解。
3.3.3聚合物絮凝剂沉淀
聚合物絮凝剂,如葡聚糖和聚乙二醇,与酶分子争夺水分子,具有脱水作用使酶沉淀。
聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中,其浓度可达到50%,浓度为6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。
这种试剂不需要低温操作,而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。
聚乙二醇不会被吸附,故在离子交换吸附前不必去除。
3.3.4用金属离子和络合物沉淀
酶和其他蛋白质都会形成金属盐,其溶解度较低。
用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后,可逆变化较差,尤其是用巯基衍生物,它结合的金属离子会催化酶变性而失活。
3.3.5用特殊试剂沉淀法
用链霉素可选择性去除核酸,从而使胞内酶沉淀出来。
链霉素盐(浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质)对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好,酶不易失活。
3.3.6亲和沉淀
将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术[15]。
将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物,该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。
配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合,溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大,只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力,甚至使亲和结合发生逆转。
引导产生沉淀的方法有:
离子交联;
加入带相反电荷的聚合物;
加入带相反电荷的疏水基团;
改变pH值,诱导产生疏水沉淀;
温度诱导产生沉淀。
亲和结合:
将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中,调节好有关沉淀的条件,使之有利于亲和结合。
洗涤:
为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合,尤其是使用带电的聚合物,离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀,因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。
其做法是:
加入适当的清洗剂重新溶解沉淀,再沉淀;
或在专一性洗脱之前,彻底清洗沉淀。
在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配基处于亲和结合状态。
配基-载体复合物与目的蛋白质的分离:
分离结束之后,要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物,目的蛋白质要达到一定的纯度,回收率要高。
总之,酶的分离纯化过程通常是几种技术的综合应用,但每一步都需要在了解蛋白本身性质的基础上对分离技术加以选择性的应用。
使酶的总回收率和纯度保持最大化是各分离技术在试验和工业应用中的基本准则,因此,实现分离纯化技术的选择和酶性质的研究两者相互促进、协调发展就是后续研究的核心问题。
4.酶的固定化
固定化酶是酶工程的核心,利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离。
下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关固定化技术的研究新进展。
4.1吸附法
利用多种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定方法。
该方法最显著的优点是操作简便,条件温和,不会引起酶的变异失活,且载体价廉易得,可反复使用。
但酶与载体结合不牢,极易脱落,所以它的使用受到一定的限制。
因此,人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。
通常,吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。
酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。
从载体对酶的适应性来看,这个方法效果是好的,酶蛋白的活性中心不易受破坏,酶的高级结构变化也不明显,但其缺点是酶与载体的相互作用较弱,被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来,不能获得较高活力的固定化酶。
该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。
纵伟、刘艳芳等(2008)以磁性壳聚糖微球作为新型载体,并采用物理吸附法固定化脂肪酶,对影响固定化的各种因素进行考察,确定了最优条件,同时比较了游离酶和固定化酶的pH值和热稳定性。
结果表明,固定化的适宜条件为:
加酶量600U/g,温度5℃,pH7.0,固定化时问2h。
固定化酶的pH值和热稳定性都优于游离酶,固定化酶连续使用5次后,其相对酶活仍为使用前的57.8%,具有较好的操作稳定性。
近年来,随着介孔分子筛制备技术的日臻成熟,人们正在考虑用其担当固定化酶的载体。
与其他材料相比,介孔分子筛规则的孔道、大的比表面积、极强的吸附性能、稳定的结构等特点,使其具有担当固定化酶载体得天独厚的优势。
王炎等(2008)以介孔分子筛MCM一41作为载体,采用物理吸附法对漆酶进行了固定化,考察了时间、pH和给酶量对固定化效果的影响,并对固定化酶的活性及其稳定性进行了研究,讨论了影响固定化过程和固定化酶性质的主要原因。
结果显示,在pH为3.0时,酶和载体比例为62.5mg/g时吸附12h固定化效果最好,固定化酶活性回收率为50%。
与游离漆酶相比,MCM一41固定化漆酶的最适反应pH略有升高,最适温度没有变化,其pH稳定性和热稳定性都显著优于游离漆酶。
固定化漆酶具有可重复操作的性质,与底物反应反复操作1O批次后剩余活性为4O%。
将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。
该方法的处理条件温和,且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化,因而可以得到较高活性的固定化酶。
采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶等。
陈姗姗等(2008)以阴离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂,对果胶酶进行固定化分析,探讨了温度、pH值、时间、加酶量、戊二醛浓度、交联温度、交联时问对果胶酶固定化效果的影响,同时对固定化果胶酶的酶学特性进行研究。
研究结果表明,果胶酶的最佳固定化条件为:
温度40℃,pH值5.5,固定化6h,加酶量为O.75mL/g,戊二醛体积分数为0.1%,交联温度4℃,交联时间4h。
在此条件下,固定化果胶酶的酶活回收率可达到80%以上。
酶学特性试验表明,固定化果胶酶最适温度为60℃,最适pH值为4.0,具有较好的操作稳定性。
徐娟等(2008)选择以D380大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为载体,通过先吸附后交联的方法固定化淀粉酶。
通过实验对影响固定化酶活力回收率的因素的进行了研究,得出较优的固定化条件为:
戊二醛浓度0.1%、处理时间45min、加酶量3mg/g(蛋白量/载体)、酶液在pH5.8、25℃,固定化处理时间6~10h的条件下,获得的固定化酶活力可达8OU/g(载体),并进一步对固定化酶的酶学性质作了初步研究。
4.2交联法
交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联,使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键嘲。
常用的交联剂是戊二醛,但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低,因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用,可以达到既提高固定化酶的活力。
刘颖、高晗等(2008)利用上述混合方法,将杏仁来源的B一葡萄糖苷酶以吸附法固定在用戊二醛交联的壳聚糖上,并对固定化条件进行优化,得到最佳条件:
戊二醛浓度为1.5%,溶液pH5.5,在25℃水浴中振荡吸附4h,固定化B一葡萄糖苷酶,其活力回收率27.34%。
王伟、杨开伦等(2008)以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,用吸附交联法对氨基酰化酶进行了固定化。
研究结果表明,在pH值为6.0,温度30℃的条件下,0.1g壳聚糖微球与5mL1%戊二醛交联后,固定O.8mg氨基酰化酶的固定化效果最佳。
固定化酶的最适温度和pH值分别为50℃和7.0,而游离酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.5,固定化酶在50-70℃都保持了较高的酶活力,热稳定性远高于游离酶,固定化酶的Km值为l1.796×
10-2之mol/L,较游离酶有所升高,该固定化酶具有良好的操作稳定性。
4.3共价键结合法
共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的一种方法。
此法研究较为成熟,其优点是酶与载体间连接牢固,即
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