生物学评价之细胞毒性试验Word文档下载推荐.docx
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•阳性对照。
是已知的有一定细胞毒性的物质。
推荐含锡的聚氯乙烯作为固体材料或浸提液的阳性对照。
稀释苯酚亦可作为浸提液的阳性对照。
4试验方法
1)琼脂覆盖法
•目的:
本试验是为了评价医疗器械科浸提成分的急性细胞毒性。
•范围:
本试验方法适用于固体(粉末,纤维状,金属),液体等试验材料。
试验样品:
将试验样品制成100mm2的圆形,要求边缘光滑整齐。
液体材料用0.1mL的样品吸收在同面积的无菌滤纸片或纤维素上。
阴性对照:
为已知五毒的材料(反应指标为0/0)高密度聚乙烯由于有良好的光学性质且易于切割被认为最为适宜。
制备方法用试验样品。
阳性对照:
为已知的有一定毒性的样品材料(反应指标为2/2),含锡的聚氯乙烯是一种较为合适的阳性对照。
制备方法同试验样品。
细胞株:
推荐使用L-929细胞株。
试验用细胞为传代(48~72)h生长旺盛的细胞。
培养基和试剂:
用于细胞培养液都应无菌。
磷酸盐缓冲液(PBS-Complete):
成分
质量/g
NaCl
8.0
KCl
0.2
Na2HPO4
1.15
KH2PO4
2.0
MgCl2·
H2O
0.5
CaCl2
1.0
加水至1000mL,过滤灭菌,4℃贮存。
中性红浓缩液:
中性红
加水至2000mL,用磁力搅拌器搅拌1h后,滤纸过滤,高压消毒,4℃避光保存。
中性活体染液:
容量/g
中性红浓缩液
PBS-Complete
99.0
避光,新鲜配备。
消化液:
为0.25%胰酶与0.2%EDTA混合液,其配比为1:
9.
培养液:
为Eagle’sMEM,内含牛血清10%~15%(胎牛血清最好),青霉素、链霉素为每毫升培养液100单位。
Eagle’s琼脂培养基:
物质量
3%琼脂
一半
Eagle’s培养基
把加热熔化的琼脂和2倍Eagle’s培养基无菌混合后置50℃水浴中备用。
试验平板:
90mm直径的玻璃培养皿,按组织培养常规灭菌。
试验步骤(在无菌条件下进行)
制备细胞悬液:
将传代(48~72)h细胞经消化液作用后,使贴壁细胞悬浮于营养液中,调节细胞悬液浓度至3×
10^5个细胞/mL。
制备平板细胞单层:
每只平板中加入10mL制备好的细胞悬液,轻轻转动培养皿,以使细胞均匀的分布在培养皿底部。
放入含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24h,使其成为融合但不稠密的网状细胞单层。
制备琼脂培养基平板:
细胞原培养液,留下融合好的细胞悬液,将混合的Eagle’s琼脂培养沿平皿壁加入平皿内,每皿10mL.轻轻转动平皿,使琼脂培养基分布均匀,并使其在室温下凝固。
染色:
有两种方法可供选择。
取10mL新鲜配制的中性红活体染色,轻轻地置于已凝固的琼脂表面中央,染液应覆盖整个表面,避开强光,37℃染色15min,倾斜平板并弃去多余染液;
将中性红染液加入熔化的Eagle’s琼脂培养基(0.1mL中红加入10mL培养基中),混合后覆盖于细胞单层上。
放置试验样品:
应立即放置样品,最迟不超过染色后1h。
将样品对称地放在琼脂表面,可轻轻加压以琼脂表面接触,但不可破坏琼脂表面,在放置样品30min内将培养放入CO2培养箱内培养24h。
试样位置:
一只阴性样品,一只阳性样品和良知相同的试样对称地放置在培养皿的琼脂表面,试样边缘距培养皿的边缘15mm,每一种试验样品至少做两只培养皿。
结果评定标准
在白色背景下,观察样品周围及样品下面脱色区范围。
在阴性样品周围和下面的细胞单层应达到标准的反应,即R=0/0,阳性样品亦应达到标准反应,即R=2/2,否则该培养皿弃之。
反应指标:
反应情况用反应指标“R”来表示,即
R=Z/L
式中,Z为区域指标(如表1-4-1所示),与脱色区大小有关;
L为细胞溶解指标(如表1-4-2所示),与区域细胞溶解的范围有关。
表1-4-1区域指标
区域指标
区域内情况
样品下和周围无可观察到的脱色区
1
脱色区局限样品下
2
从样品边缘扩散脱色区≤5mm
3
从样品边缘扩散脱色区≤10mm
4
从样品边缘扩散脱色区>10mm,但未布满整个培养皿
5
脱色区布满整个培养皿
表1-4-2溶解指标
溶解指标
脱色区域内情况
未观察到细胞溶解现象
脱色区内细胞溶解达20%以内
脱色区内细胞溶解在20%~40%之间
脱色区内细胞溶解在40%~60%之间
脱色区内细胞溶解在60%~80%之间
脱色区内细胞溶解在80%以上
反应指标应作为2个数来报告(不是一个分数),两个指标的大小都应很明显,对每一只样品应报告其区域指标的指标平均值和溶解指标的平均值。
无论何种原因,一个指标的四个值丢失了一个以上,则该试验弃之,如仅丢失了一个,则其他三个的平均值可作为指标来报告。
在同一试验中,4个相同的样品指标大小有2个或2个单位以上的差异。
如果数值在0~3以内,则应重复试验;
如数值是4~5,表示有高度弥散的毒性物质,则不必重复试验。
为了试验的可靠起见,规定每种样品重复试验一次以上,最后报告其指标的平均值。
试验报告
包括试验材料和阴、阳对照材料的化学名称、商品名称、产品批号、生产厂家以及材料试验尺寸规格与消毒方式。
指出试验用细胞名称、来源、培养基种类。
描述操作步骤:
包括制备细胞悬液、制备细胞单层、覆盖琼脂、染色等。
显微镜下观察试验结果。
对试验材料进行评价
2)分子滤过法
目的:
本试验用于试验材料的细胞毒性评价。
试验材料的准备。
试验样品
按照生产厂家的产品说明准备试验样品,将试验样品制备成直径7mm的圆形膜片,要求有一个平面,使其可以充分地与滤膜接触,试验样品的质量不应超过3g,亦可用直径为7mm的纤维素片汲取0.1mL浸提液放置在分子滤膜片上。
空白对照样品:
只长在单层细胞的分子滤膜或单纯的分子滤膜。
阳性对照样品:
推荐使用稀释的苯酚溶液作为阳性对照样品。
细胞株、培养基
人上皮细胞株(HeLa)、小鼠结缔组织成纤维细胞株(L-929)。
培养基:
用于细胞培养的培养用液都应是无菌的。
生长培养基:
采用Eagle’s培养基,加10%胎牛血清,1×
10^5IU/L青霉素,100mg/L链霉素及10mmol链霉素和10mmol/LHEPES缓冲液。
试验步骤
消化收集细胞并用生长培养基调节细胞浓度为1.5×
10^5/mL,在直径为50mm组织培养皿中放置的直径47mm、孔径0.45μm的分子滤膜加上6mL细胞悬液,在5%二氧化碳培养箱内培养24h。
加5mL约40℃的琼脂培养基于一空白的组织培养皿内,使其室温下凝固。
将用37℃磷酸缓冲液漂洗后的附有单层细胞的分子滤膜,细胞面向下放置在琼脂培养基面,每一滤膜上放置3~5个样品,每种材料测10个样品,空白对照和阳性对照操作方法相同。
放置样品后,在5%CO2培养箱内继续培养2h。
培养后移去试验样品并轻轻地从琼脂培养基上拿下分子滤膜,用细胞化学方法来测定细胞单层的琥珀酸脱氢酶的活性。
37℃孵育3h后,用蒸馏水洗涤。
风干。
结果评价
在显微镜下检查滤膜,含细胞单层的膜片染为深蓝色,没有细胞的滤膜用来观察试验材料可能对滤膜产生的影响。
按照表1-4-3判断试验样品的细胞毒性。
按照记分系统,对材料的细胞毒性进行分级、报告。
3)细胞生长抑制法[MTT(四咪唑)比色法]
(1)细胞株:
L-929(小鼠结缔组织成纤维细胞)。
评分
评价
解释
与单层细胞的其他部分比较染色无差异
无细胞毒性
存在染色浅或未染色区,其直径小于试样(7mm)
轻度细胞毒性
未染色区域为(7~11)mm
中度细胞毒性
未染色区域为12mm以上
明显细胞毒性
(2)仪器:
免疫酶标仪。
(3)培养液和试剂
详见琼脂覆盖法。
PBS缓冲液:
MTT(四咪唑):
浓度为5mg/mL溶于PBS中。
(4)样品制备:
将无菌的样品浸在培养液中(含10%胎牛血清)静置24h,浸提液量与样品表面积之比为10mL/cm2,浸提液制备好后,将其一般用培养液稀释成溶度为50%.
(5)培养(1~2)d的L-929细胞,吸收原培养液,加入消化液,消化,吸收消化液,加入新配置的培养液,使细胞成悬浮液计数,稀释成1×
10^4个细胞/mL。
接种于3块96孔塑料板上,每组4孔,每孔100μL。
在37℃CO2培养箱中培养24h,使细胞贴壁,24h后,加样品,将每孔中原培养液吸除。
空白对照加新配置的培养液100μL,试验组分分别加100%和50%样品浸提液,放入37℃CO2培养箱中培养,在2d、4d、7d时,分别各取出一块培养板,吸除样品浸提液加入20μL/孔MTT液,继续培养6h,然后吸除,再加入150μL/孔二甲基亚砜,振荡10min,在免疫酶标仪上以500nm波长测吸收值,通过下式计算相对增殖率(RGR):
(6)结果评价:
根据RGR均值,岸标1-4-4所列评分标准对样品细胞毒性程度进行评价。
表1-4-4细胞相对增殖率评价
S
细胞相对增殖率
0级
≥100
1级
75~99
2级
50~74
3级
25~49
4级
1~25
5级
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- 生物学 评价 细胞 毒性 试验