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香菇子实体较小至稍大,菌盖直径5-12cm,有的可达20cm,扁平球形至稍平展,表面菱色、浅褐色、深褐色至深肉色,有深色鳞片,而边缘往往鳞片色浅至污白色,有毛状物或絮状物,菌肉白色,稍厚或厚,细密,菌褶白色,密、弯生、不等长。
菌柄中生至偏生,白色,常弯曲,长3-8cm,粗0.5-1.5cm,菌环以下有纤毛状鳞片,内实,纤维质,菌环易消失,白色。
1.2香菇的经济价值、营养价值和保健功能
1.2.1香菇的经济价值
由于香菇特殊的营养和保健功能,近20年来国际、国内香菇的需求呈明显的上升趋势,欧、美及东南亚等发达国家香菇及其产品市场行情看好,国内香菇市场前景广阔,潜力巨大,使得香菇成为世界上发展速度最快的菇类[3]。
我国地域辽阔,气候多样,是世界上著名的食用菌生产大国,栽培香菇具有得天独厚后的优势[4]。
因此,搞好香菇及其产品的开发,将会带动香菇主产区尤其是边远山区的经济发展。
1.2.2香菇的营养价值
香菇是我国著名的食用菌,被人们誉为“菇中皇后”,深受人们的喜爱,是不可多得的理想的保健食品[3,5]。
据分析,每100香菇干品中含蛋白质18.6g,高于平菇、蘑菇、银耳等其他食用菌。
它的蛋白质组成不同于一般的粮食组成,其主要成分为白蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白,这三种蛋白质的比例为100:
63:
2,香菇所含蛋白质的品质好。
在组成香菇蛋白质的18中氨基酸中,有8种是人体必须的氨基酸,对幼儿和儿童的生长发育有利。
香菇与其它谷物混食,可充分发挥食物的互补作用,弥补营养素的不足,提高食物的养价值。
香菇干品脂肪含量在3%左右,脂肪的碘价为139,不饱和脂肪酸含量丰富,其中亚油酸、油酸含量高达90%以上。
由于香菇富含人体必需的脂肪酸,它不仅能降低血脂,又助于降低血清、胆固醇和抑制动脉血栓的形成。
香菇干品中矿物质含量较多,可作为补钙、补铁、补磷的良好来源。
此外,香菇还含有锰、锌、铜、镁、硒等微量元素,可维持肌体正常代谢从而延长人类寿命,并对某些矿物质缺乏地区儿童的生长发育具有良好的预防和治疗作用。
香菇干品碳水化合物含量高达54%左右,不同地区和品系之间含量稍有差异。
它所含的碳水化合物以半纤维素为最多,此外还有多糖、海藻糖、葡萄糖、糖原、戊聚糖和甘露醇等。
香菇干品中维生素含量较多,据研究,香菇还含有麦角甾醇和菌甾醇,前者在阳光下可转变为维生素,所以香菇是抗佝偻病的重要食物之一。
1.2.3香菇的保健及药用功能
香菇不仅是人们理想的美味佳肴,而且它的保健药用功能越来越受到人们的重视。
古代医药学家对香菇的药性及功用曾有著述,《本草纲目》认为香菇“甘、平、无毒”,《医林篡要》认为香菇“甘、寒”,“可托痘毒”。
现代医药学研究成果表明,香菇具有许多重要的医药保健功能。
1.2.3.1防治肿瘤
香菇含有多种有效药用组分,尤其是香菇多糖(LNT)具有一定的抗肿瘤作用。
LNT对慢性粒细胞白血病、胃癌、鼻咽癌、直肠癌和乳腺癌等有抑制和防止术后微转移的效果,此作用是通过肌体免疫力而对癌细胞表现间接毒性,尤其适用于病后肌体康复。
与其它抗肿瘤药物相比,LNT几乎无任何毒副作用,是目前已知最强免疫增强剂之一。
1.2.3.2增强免疫力
据研究,香菇多糖具有重要的免疫药理作用,可改善肌体代谢,增强免疫能力。
1.2.3.3降血脂、抗血栓
研究发现,香菇腺嘌呤及香菇多糖均可促进胆固醇代谢而降低其在血清中的含量。
香菇含有丰富的维生素,而维生素具有降血脂、增加冠状动脉血流量的作用,对高血压和心脑血管病具有良好的预防和治疗功能。
1.2.3.4健胃、保肝
香菇对治疗急慢性肝病如病毒性肝炎、传染性肝炎、肝硬化等有一定的疗效。
香菇多糖及其培养液有护肝作用并增强排毒能力,降低血清转氨酶水平。
常食香菇,可用于预防和治疗脾胃虚弱、腹胀、四肢乏力、面黄体瘦等消化系统疾病。
1.2.3.5预防佝偻病并治贫血
香菇含钙、铁量较高,并且含有麦角甾醇,因此现代中医认为香菇为补偿维生素D的药剂,可预防佝偻病,并治贫血。
1.2.3.6其它功能
香菇多糖及其衍生物对细菌、霉菌、病毒及爱滋病的感染均有治疗作用。
1.3香菇遗传育种进展
香菇作为大面积人工栽培的食用菌,用于栽培的菌种质量好坏,直接影响草菇的产值和经济效益,因此香菇遗传育种工作在香菇产业发展中至关重要,近30年来,我国进行香菇育种的主要途径是自然选育和杂交育种。
诱变育种方法较为少采用,细胞融合(即原生质体融合)尚在实验探讨阶段。
自然选育仍然是现在香菇育种工作主要采用的方法,我国菇民比较熟悉和欢迎的“香九”,“7925”,“沪农1号”等香菇菌种,均是采用自然选育法育成的香菇优良菌种。
自然选育主要是从野生菌株或国外引进的优良菌株中采集、分离获得。
然后进行驯化栽培,对其产量及适应性等进行试验,进而从中选育出所需的优良品系。
杂交育种:
80年代以来,我国的香菇杂交育种工作也取得了可喜的成绩。
与香菇自然选育比较而言,我国采用杂交育种方法育成的香菇菌种数量较少,在生产中,这些杂交菌种目前正在试种推广之中。
原生质体融合是70年代发展起来的新技术,原生质体融合技术为食用遗传育种和遗传学研究提供了一条新途径。
食用菌的种内、种间、属间,乃至科间原生质体融合均己有报道。
张树艇和他的学生进行了双抱蘑菇和草菇的原生质体融合研究,另外国内其他研究单位及日本等国外科研单位也有相关的报道[6]。
近30年,我国的香菇育种工作从无到有,从资源调查到自然选育,从引种驯化到杂交育种,从理论研究到实际应用,均取得了明显的成绩。
但是,由于我们起步较晚,加上科研经费不足等问题,致使我国的香菇育种水平和育种效率仍较落后。
同时,香菇生产中正在不断地产生新问题,搞好香菇育种工作,既是当务之急,又是一个长期的艰巨的重要任务。
在今后的若干年内,我国香菇育种仍将走引种驯化、自然选育和杂交育种相结合的道路。
但香菇的生产周期较长,前后约有1年时间,常规育种周期更长。
要赶上并超过世界先进水平,这就要求我们科研工作者需要寻找出新的更快、效果更好的育种途径来解决这一弊端。
随着基因工程技术的日渐成熟,使得利用分子操作手段来改变香菇基因的构成,进行香菇分子育种成为可能。
通过改造香菇基因组成,增加有益于香菇食用价值、生产、品质保存的优点,减少不利与生产推广的特点,本次实验就是朝着这个方向努力。
2分子标记及其在食用菌研究中的应用
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征,它是生物分类学、育种学、遗传学和物种进化等研究的主要技术指标之一。
当前遗传标记主要有4种类型[7]:
形态标记、细胞学标记、蛋白质标记和DNA分子标记。
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状,如株高、穗形、颜色等,形态标记简单直观,长期以来大都根据形态标记进行植物种质资源鉴定和育种材料的选择,但其数量少、多态性差,易受环境条件影响。
细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征,染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学特征。
细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点,但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择,有些标记因染色体变异的耐受性差而难以获得,有些标记伴有对生物有害的表形效应或难以观察和鉴定。
蛋白质标记主要包括同工酶和贮藏蛋白,具有经济方便的优点,但其标记数量有限,不能满足种质资源鉴定和育种工作需要。
近年来,分子生物学技术的发展为植物遗传育种提供了基于DNA多态性的分子标记。
DNA分子标记(DNAmolecu1armarker)是指可遗传并可检测的DNA序列,以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础,是DNA水平遗传变异的直接反映。
DNA分子标记的检测不受组织特异性、发育阶段等影响,并具有数量大、多态性高、遗传稳定等优势,因此在遗传育种、基因定位、基因克隆等方面应用广泛。
和其它三种标记相比,分子标记具有以下优越性[8]:
(1)大多数分子标记是共显性的,对隐性的农艺性状的选择十分便利;
(2)基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;
(3)在发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析,使得对植株基因型的早期选择成为可能。
2.1应用于食用菌研究的分子标记
广义的分子标记包括两类,即同工酶标记和DNA标记;
狭义的分子标记仅指DNA标记[9]。
2.1.1同工酶标记
同工酶是指能催化同一种反应,但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶标记既是一种生化标记,还由于同工酶的氨基酸取代作用为相应DNA所编码,因此可以看作是一种分子标记。
利用同工酶技术,可以鉴定出特定酶的不同等位基因形态,同时同工酶标记以孟德尔遗传方式进行遗传,所以是一种比较方便的分子标记[10]。
物种间的同工酶差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因或非等位基因的不同造成,因此只要酶的变异上存在明显的差异,就可以对同一物种内不同种、变种、品种、品系间的遗传差异进行有效检测,从而确定它们之间的亲缘关系。
由于等位基因同工酶受共显性等位基因控制,杂种表现互补型酶谱或杂种酶谱,因此该技术适用于杂种纯度检测。
但同工酶标记由于翻译后的修饰作用、组织特异性和发育阶段,特别是相对较少的多态性位点,使其在应用上受到一定的限制。
2.1.2RFLP标记
RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)即限制性片段长度多态性。
这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。
是一项利用放射性同位素(通常用P32)或非放射性物质(如地高辛等)标记探针,与转移于支持膜上的总基因组DNA杂交,通过显示限制性酶切片段的大小,来检测不同遗传位点等变异(多态性)的一种技术。
RFLP标记是DNA分子水平变异的反应,不受显隐性关系、发育阶段和环境条件的影响,具有稳定遗传和特异性的特点,目前较为完善的遗传连锁图谱大多来自RFLP分子标记。
尤其在构建高密度遗传连锁图方面,RFLP有独特的优越性。
此外,在亲缘关系鉴定、品种鉴定等方面,RFLP也有广泛应用。
但是.多数RFLP位点信息含量较低.且费用昂贵,操作复杂.不适用于分析样本量较大的群体。
2.1.3RAPD标记
RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)即随机扩增多态性DNA,它是以基因组DNA为模板,以一个随机的寡核苷酸序列(通常为10个碱基对)作引物,通过PCR扩增反应,产生不连续的DNA产物,用以检测DNA序列的多态性。
RAPD分析所用的一系列引物的碱基序列不同,但对于任一特定引物,它与所检测的DNA序列有特定的结合位点,虽然对每一个引物而言,其检测基因DNA多态性是有限的,但可用的引物数量很多,可检测区域几乎覆盖整个基因组,所以从理论上讲,RAPD可对整个基因组DNA进行多态性检测。
与RFLP相比,RAPD分析具有快速、简便、多态性检出率高的优点,所以,RAPD分析非常适合于研究大规模样品的植物育种、种群遗传学和生物多样性等众多研究领域。
目前该方法已广泛用于种质资源鉴定与分类、目标性状基因的标记、构建遗传图谱等方面的研究上。
RAPD技术的缺点主要在于它是一个显性标记,不能鉴别杂合子和纯合子。
此外,共迁移及重复性差的问题也限制了RAPD技术的应用。
2.1.4SRAP(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism)标记
SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统,由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出[11],又叫基于序列扩增多态性(Sequence-basedamplifiedpolymorphism,SBAP)[12]。
非编码重复序列基因组上有两种分布方式,即散布重复序列和串联重复序列,其中散布重复序列是被一些长度不等的间隔序列分开,为了分析这些间隔序列的多态性,通常采用SPAR标记技术。
SPAR技术是与RAPD技术相似的一种标记技术,SPAR引物是在SSR的基础上设计的。
这些引物能与SSR之间的间隔序列进行特异性结合,然后通过PCR技术扩增SSR之间的DNA序列,凝胶电泳分离扩增产物,分析其多态性。
该标记是通过独特的引物设计对ORFs(OpenReadingFrames)进行扩增,上游引物长17bp,5'
端的前10bp是一段填充序列,紧接着是CCGG,组成核心序列及3’端3个选择碱基,对外显子进行特异扩增。
下游引物长18bp,5’端的前11bp是一段填充序列,紧接着是AATT,组成核心序列及3’端3个选择碱基,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增[13]。
因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。
该标记具有检测简单、重复性好,每对引物都能够产生适度的多态性标记,而且其中一部分是共显性标记,能够比较容易地分离目的标记并测序等[11]。
SRAP分子标记系统最早在芸薹属作物开发出来。
目前已在马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、樱桃、棉花、柑橘和芹菜等多种植物中成功扩增,并应用于图谱构建[11,13,14]、比较基因组学[15,16]、遗传多样性分析[12,16,17,18,19]。
2.1.5微卫星(simplesequencerepeat,简称SSR)
微卫星DNA是短的、串联的简单重复序列,它的组成单元是1-6个核苷酸,例如(CA)n、(GAG)n、(GACA)n等。
由于这些序列广泛存在于真核细胞的基因组中,由于串联重复的数目是可变的而呈现高度多态性,以及在单个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析,微卫星序列作为比较理想的分子标记广泛用于遗传图谱的构建、居群遗传学以及系统发育的研究。
其原理是根据微卫星DNA两翼区域的序列来设计位点专一的引物,在PCR上扩增出单个微卫星位点,然后进行SSLP(简单序列长度多态性)分析,以及在此基础上微卫星位点的序列分析,其个体的多态行为主要是由于串联重复的次数是高度可变的。
微卫星标记具有以下特点:
共显性;
在一个居群内存在许多不同大小的等位基因,杂合水平特别高;
按孟德尔方式遗传,可用于分离和连锁分析。
其主缺点是必须事先知道微卫星两翼序列信息才能设计引物,对于许多物种需构建文库。
相对于AFLP、RFLP和RAPD等技术的局限性,如可能很难查明位点的状态(杂合/纯合)或是确定等位基因的关系,在处理大量样品时遇到的技术困难等,SSR有明显的优势。
SSR标记在数据上比前述分子标记能显示出更多的多态性,在分析具有少量位点的大量个体时显得较为有效和经济。
目前SSR被广泛应用于资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的分子标记等研究。
SSR分析技术的最大问题是必须针对每个染色体座位的SSR,测定并找到其两端的单拷贝序列设计引物,无疑这需要投入大量的人力、物力。
因此,SSR引物的缺乏是该技术的局限性之所在。
2.1.6微卫星间隔(Intersimplesequencerepeat,简称ISSR)
用微卫星(或称简单重复序列,即SSR)作为引物扩增重复序列之间的区域,故又称为InterSSR,简称ISSR,是一类新型的DNA分子标记技术。
根据植物中广泛存在简单重复序列(SSR)的特点,利用在植物基因组中常常出现的SSR来设计引物,无需预先克隆和测序,其原理和方法与RAPD类似,只是以SSR作为PCR扩增的单引物,其引物长度通常为16-18个碱基序列,由1-4个碱基组成的串联重复(有时加上几个非重复的锚定碱基)组成。
其引物由串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片断进行PCR扩增。
由于不知道目的基因组DNA的背景资料,有一些ISSR引物可能在特定基因组DNA中没有配对区域而无扩增产物。
在PCR扩增反应中,退火温度的影响是最大的。
一般在运行ISSR-PCR时,采用48-52℃退火温度都能得到好的扩增带,而且ISSR也是显性标记,模板浓度需要较一致,最适反应条件需要一定时间摸索。
2.1.7SCAR标记
SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)标记通常是由RAPD标记转化而来。
SCAR标记是将RAPD标记片断从凝胶上回收并进行克隆和测序,根据其碱基序列设计一对特异引物(18~24碱基);
也可对RAPD标记末端进行测序,在原RAPD所用10碱基引物的末端增加14个左右的碱基,成为与原RAPD片断末端互补的特异引物。
SCAR标记一般表现为扩增片断的有无,是一种显性标记,当扩增区域内部发生少数碱基的插入、缺失、重复等变异时,表现为共显性遗传的特点。
若待检DNA间的差异表现为扩增片段的有无,则可直接在PCR反应管中加入溴化乙锭,通过在紫外灯下观察有无荧光来判断有无扩增产物,检测DNA间的差异,从而省去电泳的步骤,使检测变得更方便、快捷,可用于快速检测大量个体。
相对于RAPD标记,SCAR标记所用引物较长且引物序列与模板DNA完全互补,可在严谨条件下进行扩增,因此结果稳定性好、可重复性强。
由于上述优点,SCAR标记成为目前分子标记在育种实践中能直接应用的首选标记,实际上,它也是标记辅助育种中可以直接应用的一类标记。
在近几年的研究中,很多RAPD标记、RFLP标记、AFLP标记以及一些ISSR标记已成功转化成了SCAR标记,并得到了较好的验证。
在西瓜上,许勇等[20]找到了与西瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPPO1/700并转化为SCAR标记,且建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术体系。
在小麦上,张立异等[21]利用RAPD技术对贵农21的白粉病抗性基因进行了分子标记,结果找到了贵农中的两个白粉病抗性基因的分子标记,其中一个抗病性基因相同于P38中的,来自于簇毛麦,其分子标记就是P38的RAPD标记OPH171265和OPH171400,并己转化为SCAR。
在普通大豆上,邹继军等[22]找到了与大豆灰斑病抗病基因连锁的共显性RAPD标记OPS03620580,并将其转化为SCAR标记,该标记检测93株F2群体所得结果与RAPD标记检测到的相同,对62份大豆灰斑病抗感种质资源的测试显示,在绝大部分抗感种质之间存在明显多态性。
张志永等[23]应用BSA法,通过筛选900个10个碱基的随机引物,得到了2个与单显性大豆花叶病毒抗性基因Rsa连锁的显性RAPD标记OPAS-061800和POW-05660,将与Rsa连锁距离较近的标记转化为SCAR标记。
在葡萄上,罗素兰等[24]选用BSA法,筛选出了一个与葡萄感霜霉病主效基因紧密连锁的RAPD标记OPO10-800,并将其转化为SCAR标记。
在亚麻上,薄天岳等[25]利用近等系法,筛选到一个与亚麻抗锈病基因M4紧密连锁的标记OPA18432,并将其转化为SCAR标记,目前这一标记已成功的应用于亚麻抗锈病基因M4的分子标记辅助选择育种。
2.1.8AFLP标记
AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,简称AFLP)即扩增片段长度多态性,其基本原理是,通过对基因组DNA酶切片断的选择性扩增来检测DNA酶切片断长度的多态性。
AFLP标记多态性强,利用放射性标记在变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上可检测到50~100个扩增片断。
它另一个优点是可用于没有任何分子生物学研究基础的物种,其引物在不同物种之间是通用的。
因而AFLP非常适用于遗传多样性研究、品种指纹图谱的绘制、基因定位、分子标记育种、基因组多样性检测、遗传连锁图谱的构建等领域。
AFLP技术的不足主要表现在:
对基因组DNA质量要求较高,操作成本也相对较高,且所得到的分子标记多为显性标记。
2.1.9核糖图谱(聚合酶链反应酶解图谱)
核蛋白体核糖核酸基因(rDNA)的变异一起作为种性检测标记的价值已为人们所知晓,这些基因包含着高度保守又十分多变的带区。
rDNA通常以成串的重复基因元素的简单连锁群形式出现在真菌内,每一个重复单位包含16~18S,23~28S和5.8S的rDNA和内转录顺序(ITS),在一些物种中,5SrDNA也被包含在重复单位中。
核糖图谱或PCR酶解图谱涉及到酶扩增rDNA的限制性核酸内切酶消化作用,只需要从每个单离体获取仅毫微克量的DNA,不用印迹杂交或种间杂交就能对限制基线的遗传距离进行检测。
这种方法也能用来制作更为详细的限制图谱。
核糖图谱是运用RFLPs技术的极迅速方法,已被用于对包括蕈菌类在内的数种真菌群落的分类研究上。
除上述几种常用的分子标记技术外,还有几种新兴DNA分子标记技术,如DNA指纹技术(DNAfingerprinting)简单重复序列(SimPlesequencerepeats,SSR)、单核苷酸多态性(singlenuceiotidepolymophismSNPs)[26]应用也越来越广泛,但在食药用菌中尚少应用,不一一赘述。
2.2分子标记在食用菌研究中的应用
遗传标记是食用菌细胞融合时必不可少的重要手段。
通常采用选择性遗传标记如营养缺陷型、抗药性标记和非选择性遗传标记如灭活法及形态标记。
近年来,又发展了以DNA为基础的分子标记,它不仅代表遗传变异性,而且不受环境条件影响,将有助于食用菌的遗传改良和产量的提高。
分子标记在食用菌研究中的应用主要有以下几个方面:
2.2.1品种(杂种、融合子、转化子)鉴定与遗传分析
2.2.1.1菌种、菌株鉴定及遗传分析
食用菌菌种、菌株的质量好坏直接关系到食用菌产业能否良性发展。
目前食用菌市场缺乏统一管理,菌种管理混乱,菌种退化、老化,品种混杂,同种异名、同名异种等问题严重。
分子标记技术为这一难题提供了快速、准确的鉴定手段,可以快速、灵敏、准确地用于食用菌的菌种、菌株鉴定。
在众多的分子标记技术中,RAPD标记技术以其快速、简便、多态性检出率高等优点得到广泛应用。
在对食用菌品种总的DNA进行RAPD分析的基础上,寻找其特异的RAPD标记,建立该种的DNA指纹图谱,可作为品种鉴定的分子学依据。
Khush等[27]用RAPD技术分析双孢蘑菇的野生和栽培品种,在8个异核体
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