实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告文档格式.docx
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正丁醇能使部分杂蛋白变性,过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液,AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中,而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中,通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定
根据国际酶学委员会规定,酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示,单位(U/mg••pr)来表示。
因此,测定样品的比活性必须测定:
a每毫升样品中的蛋白质毫克数;
b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色,即可求出反应过程中产生的酚含量,而碱性磷酸酶的活性单位可定义为:
在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。
3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
在环境的温度、PH和酶的浓度一定时,酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。
酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。
若继续增加底物浓度,反应速度的增加率将减少。
当底物浓度增加到某种程度时,反应速度就会达到一个极限值,即最大反引发速度(Vmax)。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示:
式中:
Vmax为最大反应速度;
[S]为底物浓度;
Km为米氏常数;
V代表反应的起始速度。
1当ν=Vmax/2时,Km=[S]。
因此,Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
2Km是酶的最重要的特征性常数,测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法,大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。
3Km和Vmax的测定:
主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。
此式为直线方程,以不同的底物浓度1/S为横坐标,以1/V为纵坐标,并将各点连成一直线,向纵轴方向延长,此线与横轴相交的负截距为-1/Km,由此可以正确球的该酶的Km值。
方程式与图如下:
本实验以碱性磷酸酶为例,测定不同底物浓度时的酶活性,再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。
实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比。
根据吸光值得大小可以计算出酶的活性,也可以从标准曲线上差得酚的含量,进而算出酶活性的大小。
二、实验材料
(一)碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定
1、样品
兔肝
2、试剂
10.5mol/L乙酸镁溶液
20.1mol/L乙酸钠溶液
30.01mol/L乙酸镁-0.01mol/L乙酸钠溶液
40.01mol/L Tris-0.01mol/L乙酸镁PH8.8缓冲液
5丙酮(分析纯)
695%乙醇(分析纯)
7正丁醇(分析纯)
80.04mol/L底物液
91mg/ml分标准液
100.5mol/LNaOH
110.3%4-氨基安替比林
120.5%铁氰化钾
130.1mg/mL蛋白标准液
14碱性铜试剂
15酚试剂
3、仪器与器材
1研钵
2刻度离心管
3刻度吸管
4电动离心机
5玻璃漏斗和玻璃棒
6托盘天平
7恒温水浴
8可见分光光度计
(二)底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响
兔肝匀浆液
10.04mol/L底物液
20.1mol/L碳酸盐缓冲液PH10(37℃)
3碱性溶液
40.5%铁氰化钾
50.3%4-氨基安替比林
6酚标准液(0.1mg/ml)
1恒温水浴锅
2可见光分光光度计
三、实验步骤
(一)AKP的提取
AKP提取实验步骤
步骤
操作
(1)匀浆
2g新鲜兔肝剪碎,加入0.01mol/L乙酸镁-0.01mol/L乙酸钠溶液6.0ml,研磨成匀浆。
匀浆倒入刻度离心管中,记录其体积,此为A液
吸取A液0.1ml于另一试管中,加PH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释,此为稀释A液(1:
50),供此比活性用
(2)除杂蛋白
在A液中加入正丁醇2.0ml,用玻璃棒充分搅拌2min,室温放置20min,用滤纸过滤
(3)丙酮沉淀AKP
滤液置于刻度离心管中,加入等体积的冷丙酮,立即混匀离心(2000r/min)5min
(4)AKP溶解
沉淀加入0.5mol/L乙酸镁4.0ml,用玻璃棒充分搅拌使其溶解,记录其体积,此为B液。
取B液0.1ml于另一试管中,加入PH8.8Tris缓冲液4.9ml,此为稀释B液(1:
50),供动力实验用
(二)AKP的比活性测定
1、AKP的活性测定
AKP活性测定实验步骤
(1)加缓冲液
取试管3支,按表操作
试剂(ml)
测定管
标准管
空白管
PH8.8Tris缓冲液
----
-----
1.0
0.04mol/L底物液
(2)温浴
37℃水浴预温5min
(3)加酶和底物
0.1mol/ml标准酚应用液待测液
(4)酶促反应
37℃准确保温15min
(5)加显色液
0.5mol/LNaOH
0.3%4-氨基安替比林
0.5%铁氰化钾
2.0
(6)显色反应
混匀,室温放置10min
(7)测吸光度
510nm处测吸光度
各管分别加入0.5%铁氰化钾2.0ml
(7)显色
充分混匀,放置15min
(8)比色测定
以6号空白管作对照,于510nm波长处比色测定
(9)反应速度计算
根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量,算出反应速度
(10)曲线绘制
以各管底物浓度的倒数(1/[|S])为横坐标,以各管反应速度的倒数(1/V)为纵坐标,作图求出Km值
2、酚标准曲线的绘制的绘制
酚标准曲线的绘制的绘制步骤
(1)反应体系设置
取洁净干燥试管6支,依次加入试剂
1
2
3
4
5
6
0.1mol/ml酚标准溶液
0.05
0.10
0.20
0.30
0.40
蒸馏水
1.95
1.90
1.80
1.70
1.60
(2)预加热
37℃水浴中保温5min
(3)加显色剂
碱性溶液
(4)显色反应
混匀后,室温放置15min
(5)比色测定
510nm波长处比色
(6)曲线绘制
以酚含量(微克)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制酚标准曲线
注意事项
1、在纯化过程中,各步加入的有机试剂要计算精确。
2、加入有机试剂混匀后应立即离心,不宜放置过久。
3、在测定酶活性时,每加入一种试剂须立即混匀,避免浑浊。
1、血清取量要准确。
2、标准曲线必须是过原点的一条直线。
3、在酶促反应中,每管加入后立即计时,保证各管反应时间一致。
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- 关 键 词:
- 实验 名称 碱性磷酸酶 分离 纯化 报告