研究生分子生物学知识点文档格式.docx

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●噬菌体展示技术

●酵母双杂交系统

●免疫共沉淀

9.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：

是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

10.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：

根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分。

1.制备凝胶试剂：

丙烯酰胺（单体）；

亚甲双丙烯酰胺（胶联剂）二者比例29：

1；

母液浓度30%；

过硫酸铵（引发剂引发交联）；

N,N,N,’N’-四甲基乙二胺（TEMED）（加速剂）十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂）2.蛋白上样缓冲液3.电泳缓冲液 

4.考马斯亮蓝R250染色液5.脱色液

11.Westernblotting基本原理:

将SDS-PAGE分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜（nitrocellulosemembrane）上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。

12.Southwesternblotting基本原理:

细胞核蛋白提取物经SDS-PAGE后,转移至NCM上,然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。

细胞死亡形式

表现

Celldeath

细胞坏死

Apoptosis

PCD:

细胞生命现象不可逆的停止细胞结构和功能的不可逆丧失。

细胞死亡并非与机体死亡同步。

正常组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。

细胞受到外来的急性的强力的致病因素作用下，细胞正常代谢活动被强行中断而引起的“意外”的、被动性死亡过程；

只见于病理情况下。

细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。

核染色质随机降解呈絮状,蛋白合成减少。

细胞膜、溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起周围炎症

指在一定的生理和病理条件下，多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制并遵循一定程序的细胞主动性死亡过程.又程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）.凋亡小体：

胞膜皱缩内陷、反折，包围凝集断裂的染色质、胞质、细胞器等形成芽状、泡状突起并分离脱落，形成一些有膜包被，内涵物不外溢的小块，称凋亡小体（apoptoticbody）。

多细胞生物体在生长发育过程中，细胞在基因调控下，按照一定时空顺序发生的受到严格程序控制的生理性死亡。

“特殊的定时自杀”

PCDApoptosis

功能性概念发育学概念形态学概念

仅存在于发育细胞可存在于发育和成体细胞

大部分凋亡是PCD。

PCD的最终结果是凋亡

某些凋亡是非程序性。

如细胞毒物诱导的凋亡

13.凋亡的生物学意义1、确保正常生长发育、2、维持内环境稳定、3、防御功能

14.细胞凋亡的形态学特征：

细胞皱缩;

2.细胞质浓缩;

3.染色质边集核膜下，呈块状、新月形，4.凋亡小体形成；

5.凋亡小体内有结构完整的细胞器。

细胞凋亡的生化特征：

染色质DNA片段化内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180～200bp整倍数的寡聚核苷酸片段。

在琼脂糖凝胶电泳中呈特征性的“梯状”条带（DNAladder：

细胞凋亡时DNA在核小体间断裂（DNAfragmentation）形成一些DNA片断，经过提取和纯化后在凝胶电泳上产生n条梯状条带，故称之为DNALadder，是判断DNA损伤的重要标准）

15.Caspase：

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶。

Caspase功能：

1.细胞骨架蛋白和核纤层蛋白，导致细胞解体成凋亡小体

2激活DNA酶（Caspase-activatedDNase，CAD）。

CAD:

Caspase激活的DNA酶正常情况下CAD与其抑制剂ICAD结合，在胞质内，无活性。

凋亡时Caspase水解ICAD,游离的CAD有活性，进入胞核，切割DNA。

3灭活凋亡抑制物:

如Bcl-2、ICAD

4水解与DNA损伤修复相关的酶和蛋白质

如聚ADP核糖多聚酶（poly-ADP-ribosepolymerase,PARP）

16.死亡受体途径---外源性途径：

死亡受体TNFR1、Fas、CAR1、NGFR、DR3、DR4、DR5等是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。

通路（pathway）死亡配体（细胞外）-死亡受体（细胞膜）--相关蛋白（中介蛋白，细胞质内）--激活Caspase8—激活Caspase3---细胞凋亡

17.线粒体损伤途径---内源性途径：

线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。

①释放细胞色素C（Cyt.c）

②释放凋亡诱导因子（apoptosisinducingfactor，AIF）和限制性核酸内切酶G（EndoG）③释放Smac/Diablo（thesecondmitochondria-derivedactivatorofcaspase,Smac）（directIAPbingdingprotein,Diablo）④释放活性氧ROS

18.

细胞周期：

1.G1期（first 

gap）　从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。

该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。

这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。

2.S期（synthesis）　即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。

DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。

3.G2期（secondgap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。

在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。

4.M期：

细胞分裂期。

19.细胞周期蛋白或周期素（Cyclins）：

一类结构类似、能结合并调节CDK活性的蛋白家族，哺乳动物至少有10种，14个成员（cyclinA、B1-2、C、D1-3、E、F、G1-2、H、I、K）。

cyclins-CDKs-CKIs系统

20.HIF-1a：

几乎参与了对糖酵解每一步的调控；

PI3K/Akt途径；

Myc；

P53等

21.Cyclin：

周期素/周期蛋白，是CDK（周期素依赖的蛋白激酶）的调节亚基，分别在细胞周期的不同时期积累，激活CDK，使其具有催化关键底物的磷酸化修饰并调节其活性。

参与细胞周期中不同时相的调节。

22.G1/S检验点：

在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点（restrictionpoint），控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：

DNA是否损伤？

细胞外环境是否适宜？

细胞体积是否足够大？

23.cyclinbox：

各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒（cyclinbox），是与CDK相互作用的活性区域。

24.RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是将双链RNA导入细胞内引起特异基因的mRNA降解的一种细胞反应过程。

属于转录后基因沉默的一种。

25.试述CDK1活性的调控机制？

CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。

激活因素中，目前认为CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种调节因素。

抑制因素中，CDK的N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调节因素。

磷酸化修饰的激活作用：

CDK的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr161和CDK2的Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。

催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK（CDKactivitingkinase），是另一种蛋白激酶CDK7-CyclinH复合物。

当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。

磷酸化修饰的抑制作用在人的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15残基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。

催化Thr14和Tyr15磷酸化的是两种不同的蛋白激

酶，使Thr14磷酸化的为蛋白激酶Myt1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1。

催化Thr14和Tyr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。

26.DNA损伤又称基因突变：

是DNA复制过程中发生的DNA核苷酸序列的改变，从分子水平看是DNA分子碱基顺序或数目的改变。

突变的形式包括：

替换、插入、缺失、重排。

27.突变形式：

（一）点突变：

指DNA分子上一个碱基对的变异，碱基替换包括：

转换（同型）、颠换（异型）典型疾病：

镰刀型细胞贫血，碱基颠换AT-TA；

（二）插入和缺失-框移突变（frame-shiftmutation）:

缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸种类、排列顺序发生改变。

（地中海贫血）

（三）重排：

指DNA分子内发生较大片段的交换，也称重组。

移位的DNA片段可在新位点颠倒方向反置（倒位），也可在染色体之间发生交换重组。

突变的意义：

产生新基因，出现新性状，为生物进化提供了最原始、最根本的的材料，是进化的分子基础

28.DNA损伤的修复：

指针对已发生的缺陷而进行的补救机制。

直接修复：

修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除DNA或切除碱基。

包括1.光修复、2.链断裂的直接重接、3.碱基的直接插入、4.转甲基作用

切除修复（excissionrepair）：

在DNA内切酶、外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等多种酶的共同作用下，先将DNA受损的单链部位切除，然后以另一条链为模板，合成一段正确配对的碱基序列来修补缺口。

DNA损伤最普遍的修复形式。

切除修复的特点：

（1）切除修复利用的是化学能ATP，也叫暗修复。

（2）修复发生在复制前。

（3）修复的对象是亲代DNA。

重组修复：

当DNA损伤较大、较严重，无法及时修复或缺乏切除修复酶系统，可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后，在重组基因rec编码的酶（Rec蛋白）、DNA聚合酶、DNA连接酶等的作用下，将无损母链的DNA片段移到子链缺口，进行重组修复。

发生在复制后，故又称“复制后修复”

DNA损伤重组修复的过程及特点：

过程：

（1）复制：

损伤母链复制时，越过损伤部位，子链对应位点留下空缺；

无损母链复制成完整双链。

（2）重组：

空缺诱导产生重组酶（Rec蛋白），RecA与空缺区结合，并催化子链空缺与无损母链相应片段重组交换（RecBCD蛋白）;

有缺子链与无损母链重组，空缺转移到无损母链，有缺子链完整，损伤母链仍然保留。

（3）再合成：

转移后的母链空缺以新的互补子链为模板，在DNA聚合酶和连接酶的催化下，重新修复缺口;

DNA链的损伤并未除去，随着复制的继续，损伤ＤＮＡ链将在群体中逐步“稀释”。

修复发生在复制后，对象是子代DNA.

SOS修复：

DNA严重损伤难以复制或DNA复制系统受抑制的紧急情况下，为了保证DNA链的完整性，应急产生校对功能低的修复酶，采用填补任意碱基的修复方式。

这是具有差错的修复，是对极为不利的外界环境的应急反应，故称SOS修复，也称差错倾向修复。

SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物。

细胞能存活，但变异率高，DNA保留错误较多，会引起广泛、长期的突变。

自然界也因此而变得生物种类繁多。

信号转导通路★★★

29.受体：

是细胞膜上或细胞内可以特异地识别与结合化学信号物质（配体）并能激发靶细胞产生特异生物效应的特殊蛋白质分子。

G蛋白：

广义的G蛋白是指所有能与GTP或GDP结合的蛋白质。

细胞信号转导中扮演重要角色的G蛋白主要有两类：

异三聚体G蛋白（与膜受体偶联，位于细胞膜内侧，由三个亚基组成，一般称为经典G蛋白或大G蛋白。

）、单体G蛋白（存在于不同的细胞部位的小分子量G蛋白，也称为“小G蛋白”，是单亚基蛋白。

Ras是第一个被发现的小G蛋白。

）

SH2结构域：

由约100个氨基酸残基组成，中心为反向平行的β片层结构，两侧为α螺旋。

SH2介导信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子的结合，并与磷酸化酪氨酸的磷酸基团结合。

这种结合依赖于酪氨酸残基的磷酸化及其周围的氨基酸残基所构成的模体（motif）。

不同的蛋白质分子含有结构相似但并不相同的SH2结构域，因此对于含有磷酸化酪氨酸残基的不同模体具有选择性。

SH3结构域：

由55-75个氨基酸残基组成,形成一个扭曲β桶状结构。

SH3结构域介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子的结合，其亲和力与脯氨酸残基及邻近氨基酸残基所构成的模体序列相关。

30.1.简述细胞膜受体的类型及其特征：

2.举例说明cAMP-PKA信号传递途径。

cAMP对肌细胞中糖原分解合成的调节作用

肾上腺素

肾上腺素分泌，与膜受体结合，通过G蛋白偶联激活腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP↑，cAMP通过激活PKA（依赖cAMP的蛋白激酶）行使功能，PKA*

3.试述RTK－Ras－MAPK信号传递途径。

该途径的信号分子：

生长因子类EGF、PDGF、IGF、FGF、VGEF等

RTK：

受体酪氨酸激酶（与配体结合及受体二聚化/寡聚化使酶激活）

Ras蛋白：

Ras蛋白是细胞内的一种小分子单体GTPase，像其它单体GTPase和G蛋白三聚体一样，非活化状态时结合GDP，在外源信号的作用下释放GDP，结合GTP，本身即被激活，Ras蛋白亦具有GTPase活性，将GTP水解成GDP，Ras蛋白本身又回到非活化状态。

但Ras蛋白水解GTP的速度比Gsα至少慢100倍。

MAPK：

有丝分裂原活化蛋白激酶或微管相关蛋白激酶，属Ser/Thr激酶，是接受膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子，在多种受体信号传递途径中具有关键性作用。

31.抑癌基因（tumorsuppressorgene）：

又称为抗癌基因（antioncogene）是一类在正常情况下对细胞增殖有负调控作用，而在两个等位基因都缺失或失活时可促进肿瘤形成的基因。

常见的有p53、Rb、VHL、APC

32.p53的功能：

（1）抑制cyclinA的表达；

（2）抑制DNA聚合酶与DNA复制起始复合物的结合；

（3）激活抑制细胞分裂的基因；

（4）抑制癌基因对细胞的转化。

33.基因诊断:

采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。

是病因的诊断。

分子生物学相关实验

34.PCR-RFLP：

多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析，靶基因PCR扩增、扩增的DNA片段限制性酶切图谱（长度多态性）。

主要用于核酸变异性分析与比较。

35.PCR-SSCP（诊断有无突变）：

聚合酶链反应-单链构象多态性分析（singlestrandconformationpolymorphism）的简称，原理是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无突变。

广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。

并不能鉴别所有的突变。

36.PCR-southernblot或Dotblot技术：

是将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，然后放射自显影，来检测有无特定的扩增片段及相对含量，现已广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病原体特异基因等方面的研究及检测。

37.核酸分子杂交：

按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。

38.原位杂交：

用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行（insituhybridization）杂交,叫原位杂交。

可用于DNA、RNA定位研究。

39.DNA印迹技术（Southernblotting）：

Southern印迹杂交常用于探测DNA的限制性内切酶图谱。

通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱的变化，可判断是否发生了明显的DNA突变。

PCR过程及原理：

又叫体外基因扩增技术。

利用人工合成的一对引物，在被扩增DNA模板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。

组成体系：

templateDNA.atleastacoupleofprimer（长度：

20bp左右;

碱基分布:

均匀随机，G+C含量:

40-60%;

引物自身不存在发卡结构;

两个引物间不能互补；

引物与非特异靶区段同源性不能超过70%；

5‘端可修饰（酶切位点）--方便基因隆）；

Taq酶；

四种底物dNTPs；

buffer（包括Mg2+）。

①变性：

将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链变成单链

②退火：

降低温度至56℃使引物与模板DNA单链结合

③延伸：

将温度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引物3’端进行延伸，使原模板DNA的一条链变成两条链。

Taq酶的特性：

a）耐热

b）缺乏校正活性（3’-5’外切酶活性），相对容易错误掺入

c）合成速度:

1200bp/min

d）在新链3’-端额外加上一个A

e）有5’-3’外切酶活性，可以realtimePCR

40.DNA芯片技术：

是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。

41.基因转移的方法：

1.逆转录病毒载体（生物学）；

2.脂质体；

3.直接注射；

4.受体介导基因转移技术；

5.磷酸钙共沉淀法；

6.电穿孔法；

7.基因枪法；

8.显微注射法。

42.RNAi（RNAinterference）：

是指在生物体细胞内，短双链RNA（dsRNA）引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。

一种转录后水平的同源靶基因沉默，RNAi能达到基因敲除的效果。

43.SiRNA制备方法比较

44.

基因工程一般步骤：

1.分离目的基因（化学合成、制备DNA文库、制备基因组文库、PCR）；

2.DNA切割（限制性内切酶vector和目的基因片段）；

3.连接；

4.转化：

b）E.Coli细胞转化:

CaCl2法制备感受态细菌

a）真核细胞转化:

b）micro-injection（微注射）（细胞核大）

c）磷酸钙共沉淀法（贴壁细胞）

d）electroporation（电穿孔,电激,电击）（悬浮细胞）

e）基因枪（贴壁细胞/组织块）

f）liposome（脂质体）

5.筛选重组体：

蓝白筛选（α-互补法）；

营养缺陷互补法；

抗生素抗性互补。

genemanipulation

45.

Expressionvector：

就是在克隆载体的骨架的基础上增加表达原件，如启动子、目的基因、终止子、标记基因，使目的基因能够表达的载体。

46.Plasmid：

质粒，指一种小环状DNA分子，存在与细胞染色体外，能够自主复制产生特定的功能。

47.LncRNA：

长链非编码RNA，由基因组编码产生，长度大于200个核苷酸，没有编码蛋白的能力。

48.Palindrome：

回文序列，也叫作反向重复序列，指核酸序列的5`-3`方向与其另一条链相同。

49.CRISPR：

是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制，

Cas9蛋白有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA的两条单链。

Cas9先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAN序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链的切割，使DNA双链断裂。

50.基因工程常用的酶：

限制性内切酶、反转录酶、TaqDNApolymerase

51.请设计一个QRT-PCR实验，简述其原理，过程。

（可以结合文献，举例说明）。

qRT-PCR：

（荧光定量PCR）在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程中每一轮循环产物的累积数量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

逆转录-聚合酶链反应，提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA.

反应体系：

SYBRPremixExTaq：

含有TaKaRaExTaq,dNTPmixture,Mg2+,SYBRGreenI等。

52.请设计一个载体，在大肠杆菌细胞中表达一个目的基因（举例说明）。

RecombinantDNATechnology--Processofcloning:

1.Isolationoftargetgene（分离目的基因）

2.Selectionandconstructionofvectors（载体的选择和构建）

3.LigationoftargetDNAandvector（载体与目的基因结合）

提取质粒，限制酶切割质粒，用限制酶