超氧化物歧化酶.ppt
- 文档编号:2194575
- 上传时间:2022-10-27
- 格式:PPT
- 页数:18
- 大小:395KB
超氧化物歧化酶.ppt
《超氧化物歧化酶.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《超氧化物歧化酶.ppt(18页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)的生产的生产第六组钱龙SOD知识简介知识简介1.SOD的概念的概念超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶,是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。
属酶,是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。
2.SOD的分类的分类按其结合的金属离子可分为按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种三种SOD知识简介知识简介3.SOD的理化性质的理化性质3.1SOD对氰化物和对氰化物和H2O2的敏感性的敏感性长时间用过氧化氢处理可使长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和和Fe-SOD失活,而失活,而Mn-SOD不受影响不受影响3.2SOD的吸收光谱特性的吸收光谱特性CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。
由于色氨酸和酪具有独特的紫外吸收光谱。
由于色氨酸和酪氨酸的含量较低,它在氨酸的含量较低,它在280nm处并没有最大吸收峰。
处并没有最大吸收峰。
CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在的可见光最大吸收波长都在680nm左右,左右,这反映了酶分子中这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。
的光学特性。
SOD知识简介知识简介3.3SOD稳定性及影响因素稳定性及影响因素3.3.1PH、热、蛋白酶的影响:
、热、蛋白酶的影响:
SOD在在pH5.39.6间催化性能间催化性能良好,在良好,在pH4.5pH11间能稳定存在。
间能稳定存在。
pH3.6时,时,CuZn-SOD中中95%的的Zn要脱落,在要脱落,在pH12.2时,时,SOD的构象会发生不可逆的转的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。
变而使酶失活。
3.3.2SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。
当离子强度对热的稳定性与溶液中离子强度有关。
当离子强度很低时很低时,即使加热到即使加热到95,其活性损失也很少其他因素:
其活性损失也很少其他因素:
SOD活活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响,性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响,只有在无色、近中性、无乙醇饮料中只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。
另外还发活性较稳定。
另外还发现有机溶剂和现有机溶剂和Cl对对SOD的活性具抑制作用的活性具抑制作用SOD的作用的作用welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience它催化超氧阴离子转化为它催化超氧阴离子转化为H2O2和和O2的反应,的反应,即催化即催化超氧阴离子自由基超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应,发生歧化反应,从而清除从而清除O2-,2O2-+2H+H2O2+O2,在生命体的自我保护系统中起在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用,着极为重要的作用,在免疫系统中也有重要的功,因而在免疫系统中也有重要的功,因而它能防御氧毒性,增强机体抗辐射损伤能力,防衰老。
它能防御氧毒性,增强机体抗辐射损伤能力,防衰老。
实训目的实训目的
(1)掌握)掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
酶的提取、分离、检测一般步骤。
2)了解酶在提取过程中的两个参数:
回收率、纯)了解酶在提取过程中的两个参数:
回收率、纯化倍数。
化倍数。
3)掌握离心机的使用。
)掌握离心机的使用。
实训原理实训原理welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,中间物的积累在滞留,生成带色的中间产物,中间物的积累在滞留3045s后,后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,的范围内,中间物在中间物在420nm波长处有强烈光吸收。
波长处有强烈光吸收。
当有当有SOD存在时,由于它能催化存在时,由于它能催化O2-与与H+结合生成结合生成O2和和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过测定,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过测定光吸收即可求出光吸收即可求出SOD的酶活性。
的酶活性。
实训器材实训器材welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience大蒜,冷丙酮大蒜,冷丙酮,磷酸缓冲液(磷酸缓冲液(PH7.8,0.05mol/L)氯仿氯仿-乙醇混合液乙醇混合液邻苯三酚邻苯三酚浓盐酸仪器:
浓盐酸仪器:
天平、天平、石英砂、石英砂、研钵、研钵、冷冻离心机、冷冻离心机、50mL离离心管心管(8)、)、紫外紫外-可见分光光度计、可见分光光度计、250mL三角瓶(三角瓶(8个)、个)、玻璃棒玻璃棒(8根)、根)、试剂瓶试剂瓶250mL(3个)、个)、500mL(3个)、个)、250mL烧杯烧杯(16个)、试管带胶个)、试管带胶塞塞(80根根)、移液管、移液管(5根根)SOD的生产的生产1.SOD酶的提取酶的提取称取称取5克大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞后,克大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞后,加入加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液(的磷酸缓冲液(pH7.8)15ml,继,继续研磨续研磨20min,使使SOD酶充分溶解到缓冲液中,然后酶充分溶解到缓冲液中,然后6000r/min冰冻离心冰冻离心15min,放弃沉淀,取上清液。
,放弃沉淀,取上清液。
2.去除杂蛋白去除杂蛋白上清液中加入上清液中加入0.25倍体积的氯仿倍体积的氯仿乙醇混合液搅拌乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心离心15min,放弃沉淀,得到的上清,放弃沉淀,得到的上清液即是粗酶液液即是粗酶液SOD的生产的生产3.SOD酶的沉淀分离酶的沉淀分离粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%,持续搅拌,持续搅拌15min,6000r/min离心离心15min,得到,得到SOD酶酶沉淀沉淀4.将沉淀溶入将沉淀溶入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液5mL中,中,然后然后6000r/min离心离心15min,放弃沉淀,取上清液,用,放弃沉淀,取上清液,用凝胶凝胶sephacylS-200进行纯化,然后超滤浓缩。
进行纯化,然后超滤浓缩。
SOD的生产的生产5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。
将浓缩冷冻干燥后即得成品。
连苯三酚自氧化速率的测定连苯三酚自氧化速率的测定取取4.5ml缓冲液,在缓冲液,在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入10连苯连苯三酚液,迅速摇匀三酚液,迅速摇匀空白:
取空白:
取4.5ml缓冲液,在缓冲液,在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入10缓冲液,迅速摇匀缓冲液,迅速摇匀倒入光径倒入光径1cm的比色杯中,在的比色杯中,在325nm波长下于恒温池中波长下于恒温池中每隔每隔30s测测A值一次值一次计算线形范围内,每计算线形范围内,每1minA的增值,此即连苯三酚的自的增值,此即连苯三酚的自氧化速率,要求自氧化速率控制在氧化速率,要求自氧化速率控制在0.07OD/min酶活测定酶活测定测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同取取1.5ml缓冲液,在缓冲液,在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入3ml酶液,加入酶液,加入10连苯三酚液,迅速摇匀连苯三酚液,迅速摇匀空白:
取空白:
取1.5ml缓冲液,在缓冲液,在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入3ml酶液,加入酶液,加入10缓冲液,迅速摇缓冲液,迅速摇匀匀计算加酶后连苯三酚自氧化速率计算加酶后连苯三酚自氧化速率SOD的生产的生产试剂试剂/ml空白空白管管对照管对照管OD1提取液提取液OD2粗酶液粗酶液OD2酶液酶液OD2PH8.3缓冲液缓冲液33333SOD提取液提取液000.10.10.1蒸馏水蒸馏水21.81.71.71.7室温放置室温放置20min邻苯三酚邻苯三酚00.20.20.20.2结果计算结果计算酶活力单位酶活力单位提取液酶活力单位:
提取液酶活力单位:
=2(OD1-OD2)5/0.1=粗酶液活力单位:
粗酶液活力单位:
=2(OD1-OD2)5/0.1=酶液活力单位:
酶液活力单位:
=2(OD1-OD2)5/0.1=总活力总活力提取液总活力提取液总活力U=活力单位活力单位总体积总体积=粗酶液总活力粗酶液总活力=活力单位活力单位总体积总体积=酶液总活力酶液总活力=活力单位活力单位总体积总体积=比活力比活力提取液酶液比活力提取液酶液比活力U/mg=活力单位活力单位/蛋白质浓度蛋白质浓度=粗酶液比活力粗酶液比活力U/mg=活力单位活力单位/蛋白质浓度蛋白质浓度=酶液比活力酶液比活力U/mg=活力单位活力单位/蛋白质浓度蛋白质浓度=注意事项注意事项welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience1.SOD的安全性的安全性大量试验和临床应用表明,大量试验和临床应用表明,无论何种给药方式,除罕无论何种给药方式,除罕见的超敏反应外,见的超敏反应外,SOD对人体无毒性。
虽然对人体无毒性。
虽然SOD是是Mr在在30000以上的蛋白质,以上的蛋白质,但却未发现具有抗原性,但却未发现具有抗原性,其原因其原因也正在进一步研究中。
也正在进一步研究中。
2.SOD生产时的注意事项生产时的注意事项2.1在破碎细胞时要注意安全,一定要破碎的彻底在破碎细胞时要注意安全,一定要破碎的彻底2.2PH的控制力度很重要,以及在实验中的温度等的控制力度很重要,以及在实验中的温度等2.3要学会正确使用分光光度计要学会正确使用分光光度计
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 超氧化物歧化酶
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)