第三章 酶的分离纯化与制剂Word文件下载.docx
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(2)由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性,因此可应用各种亲和分离法;
而且,当这些物质存在时,酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化,这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。
3.酶活性测定贯穿纯化过程的始终
⏹酶活性测定应贯穿于整个纯化过程的始终。
酶具有催化活性,通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉,为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。
也就是说.从原料开始,整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较,这样,我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件,它们分别使酶的纯度提高了多少,回收了多少酶,从而决定其取舍。
第二节酶的抽提
⏹抽提的要求是要将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。
抽提包括以下环节。
一、预处理和破细胞
⏹在着手酶的提取前,通常应先对酶的原料进行适当的预处理(Pretreatmention),例如:
动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织;
油质种子最好先用乙醚等脱脂;
种子研磨前应去壳,以免丹宁等物质着色污染;
对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。
而且在这些预处理后,尽可能以非常新鲜的状态直接应用,否则,应将完整材料立即冰冻保存。
酶,根据它的分布可分为细胞内酶(intracellularenzyme)和细胞外酶(excellularenzyme)。
⏹细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中,因而没有破细胞问题;
而细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来,而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。
“周质酶”(Periplasmicenzyme)通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放。
⏹“膜结合酶”(membrance-bindingenzyme)则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题;
有些情况下.蛋白质或酶在合成以后,以无活性的状态作为“包含体”(inclusionbody)形式积累,在分出包含体后还有一个蛋白质复性的问题。
⏹破细胞(“celldisruption),动、植物材料通常用绞肉机作成组织糜,如果需要破碎得更彻底些,可用高速组织捣碎器(waingblendor)捣碎,或者加砂研磨。
高速捣碎器操作简便、破碎效果高,但易引起局部温度过高,导致酶失效,故必须考虑酶的特点谨慎使用。
加砂研磨.特别是用玻璃粉或氧化铝代替砂时,要注意有时也可能发生吸附变性。
在上述机械处理后,为了有利于下一步袖提,可进一步作成丙酮干粉,或者进行反复冰冻溶解处理。
量少时,某些组织还可采取匀浆器(homogenizer)将细胞研磨破碎得更细更彻底。
⏹“丙酮干粉”(acetonepowder)处理法也适用于微生物材料,一般程序是先将材料粉碎、分散,然后在O℃以下的低温条件下,加入5~10倍预先冷至约-20℃的丙酮,迅速搅拌均匀,随即过滤,最后低温干燥,研磨过筛。
丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁(膜),另一方面由于丙酮是有机溶剂,这种处理也有利于除去大量脂类物质,以免它在以后的步骤产生干扰,同时这种处理还能使某些膜结合酶易于溶解。
此外,丙酮干粉含水量低,便于保存。
但是应注意的是丙酮可能引起某些酶变性失效,有些酶则根本不能采用此法。
⏹
⏹微生物,由于种类不同,来源不同,处理的方法与难易程度也有些差异。
霉菌通常比较容易对付,通过机械剪切、研磨或者加细胞壁溶解酶就能解决。
对于细菌,少量的材料可用超声波破碎器和溶菌酶等处理,大量材料可用丙酮干粉法,或用自溶法(autolysis)。
⏹所谓自溶,就是将浓的菌体悬液在适宜的温度与pH条件下直接保温,或加甲苯、乙酸乙酯以及其他溶剂一起保温一定时间,让菌体自溶液化。
此法有人认为不是好方法,理由是:
⏹第一.自溶液中成分十分复杂;
⏹第二.有破坏目的酶的危险。
在工业生产中,细菌材料还可以用细菌磨或挤榨器等处理。
至于酵母细胞,由于其壁厚较难对付,过去多用自溶法。
⏹后来采用的办法有:
①细胞壁溶解酶处理法;
②稀盐溶液振荡法;
③冷热破壁法。
二、抽提
细胞破碎后,可采用两种方式进行抽提:
⏹一是“普遍”抽提;
二是选择性抽提,即先后用不同溶剂进行选择性抽提。
例如,用小浓度的乙醇选择性抽提肝匀浆中的酿。
如果目的酶集中于细胞器或包含体,则可先通过差别离心将这些颗粒体从细胞匀浆中分离出来,然后再将酶从细胞器中抽提出来,或将酶复性释放出来。
⏹由于大多数酶属于球蛋白类,一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶液。
但抽提液的具体组成和抽提条件的选择则取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。
1.pH
⏹首先应考虑的是酶的酸碱稳定性,选择的pH不能超出酶的稳定范围。
其次,从最佳的抽提效果而言,选择的pH最好远离目的酶的等电点。
也就是说,酶如果是酸性蛋白质,则宜用碱性溶液抽提,反之,碱性蛋白质宜用酸性溶液。
例如.从肌肉中抽提甘油醛-3-磷酸脱氢酶,以稀碱溶液效果最好,产量较高;
胰蛋白酶的抽提,通常选用O.125Mol/L的硫酸,这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外,这种抽提条件下溶入的杂质也较少。
最后,考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系,通常以选用PH4~6为佳。
2.盐
⏹大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度,所以,抽提液一般采用等渗盐溶液,最普通的有0.020~0.050mol/L的磷酸缓冲,0.15mol/LNaCl溶液等。
焦磷酸钠溶液和柠檬酸纳缓冲液,由于有助于切断酶和其他物质的联系,并有螯合某些金属的作用,因此用得也很多。
某些报道表明,少数情况下,如抽提霉菌脂肪酶,用水的效果亦佳,这可能与低渗可破坏细胞结构有关。
3.温度
⏹通常,抽提温度多控制在0℃~4℃左右。
如果待纯化的酶比较稳定,则可以例外。
例胃蛋白酶就可在37℃条件下保温抽提。
⏹4.其他
⏹在破细胞时,某些亚细胞结构也往往受到损伤,这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。
因此,有时在抽提液中还需要加入某些物质。
例如,为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride,PMSF);
为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、DTT(dithiothreitol)以及惰性蛋白和底物等。
抽提液的用量通常为原料星的1~5倍,有时为了提高抽提效果,要进行反复抽提.这样,液量就可能大些。
⏹抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成分一般可用离心法或压滤法除去,植物原料的抽提液在冷室中放置过夜往往就会自动澄清。
某些情况下,在进行抽提液离心前,加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙胶等物质,常有助于除去悬浮的胶体物质。
近年来为了使分离纯化工作简化,开发了一种将抽提液的分离和相继的纯化步骤结合在一起的技术,称为“扩展床吸附层析”(expandedbedadsorptionchromatography)。
⏹通过这一技术人们可以直接从含有颗粒体的物料,如发酵液、细胞破碎液中截获所需要的蛋白质或酶,移去颗粒成分.从而免除了离心、过滤.甚至浓缩等繁复的下游(downstream)步骤。
这种技术从原理上言实际上就是一种“流动”(fluidization)吸附分离。
但是,它需要采用特殊的吸附剂和专门设计的柱装置,商品称为“STREAMLINE"
。
在这一系统的操作过程中吸附剂始终处于悬浮状态,物料流输入扩展床后,推动吸附颗粒向上,没有回流,靶蛋白被吸附,而细胞碎片、细小颗粒和其他杂质则无阻滞地流出;
吸附完成后,被吸附的靶蛋白可再反向洗出。
三、浓缩
⏹抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低,所以在进行纯化前往往须先加以浓缩(concentration),这样一方面可使每一步的回收率升高,同时,酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较高。
常用的浓缩的方法有以下几种。
⏹1.蒸发
⏹一般的减压蒸发浓缩除了效率低、费时外,有时还要加热,并且可能产生泡沫,易使蛋白质变性失效,因此,不能用于稳定性较差的酶。
同时,蒸发过程还可能出现增色现象,影响产品的质量。
⏹过去实验室中也采用超蒸发浓缩法,即让暖空气流通过冷的酶溶液表面,或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发,但此法效率不佳。
⏹工业生产上现在应用较多的是薄膜蒸发浓缩,即将待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的液膜,并使之与大面积热空气接触,让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。
由于水分蒸发时能带走部分热量,所以,只要真空条件好,酶在浓缩过程中实际受到的热作用不强,因而可用于热敏性酶类的浓缩。
薄膜蒸发浓缩器有三种形式:
升膜、降膜和刮板。
对于较粘稠的样品,后一种形式似乎更为适合,不过薄膜浓缩常会带来增色现象。
2.超过滤(ultrafiltration)
⏹这是在加压情况下,将待浓缩液通过一层只容许水分子和小分子选择性透过的微孔超滤膜.而将酶等大分子被滞留,从而达到浓缩目的的一种技术。
这种方法的优点是:
没有热破坏;
没有相变化;
保持原来的离子强度和pH;
如果膜选择适当,浓缩过程还可能同时进行粗分,成本也不高,故为人们所乐用。
超过滤可用于小量样品,也可用于工业生产规模,现在已有各种超过滤装置可供选择。
3.胶过滤(gel-filtration)
⏹这是利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50等能吸水膨润,而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的一种浓缩.通常采用“静态”方式,应用这种方法时,可将干胶直接加入样品溶液,胶吸水膨润一定时间后,再借助过滤或离心等办法分出浓缩的酶溶液。
⏹胶过滤浓缩法的优点是:
条件温和,操作简便,也没有pH与离子强度等的改变。
4.反复冻融(freeze-thawing)
⏹此法的原理是溶液相对纯水,会发生融点升高、冰点降低的现象。
实施时可采用两种方式进行:
一是先将溶液冻成冰块,然后使之缓缓溶解,这样,几乎不含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面,而酶等则融解并集中于下层溶液(至原体积的四分之一左右);
另一种则是先让酶溶液缓缓冻凝,尔后再移去形成的冰块。
冻融浓缩的主要问题是,浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变化,从而导致酶失效,其次是需要大功率的致冷设备。
5.其他
⏹如聚乙二醇浓缩法等,它们一般只能用于小量样品,而且成本很高。
第三节酶的纯化原理与方法
⏹在抽提液中,除了目的酶以外,通常不可避免地杂有其他小分子和大分子物质。
其中,小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去,因此比较容易解决;
大分子物质包括核酸、粘多糖和其他蛋白质。
核酸和粘多糖往往会干扰以后的纯化,特别是细菌等的抽提液中
⏹常含有大量核酸,最好预先除去。
核酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或MnCl2等使之沉淀移去,必要时也可使用核酸酶。
粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解.有时也可用酶。
这些杂质移除后,余下来的就是杂蛋白。
⏹纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作,就是要将酶从杂蛋白中分离出来。
⏹酶与杂蛋白的分离,可参照已有的方法,也可另外设计和建立新的工艺流程。
但为了获得较理想的分离效果应注意以下问题:
⏹
(1)工作前应对所要纯化的酶的理化性质如溶解度、分子大小、电学解离性质和酶的稳定性等有一个较全面的了解.这样,就可以知道应选择哪些方法与条件,而应避免哪些处理,以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。
⏹
(2)判断选择的方法与条件是否适当,始终应以活力测定为准则。
一个好的步骤应该是比活力(纯度)提高大、总活力回收高,而且重现性好。
一般地说,纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件,因为这样只能使酶的总活力下降,而不能使酶的纯度进一步上升。
⏹(3)要严格控制操作条件,这样,一方面可保证高的重复率,另一方面又可防止酶的变性失效,特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、溶液中的蛋白浓度逐渐下降,蛋白质间的相互保护作用随之减小.酶的稳定性也因之降低,这一点尤为重要。
⏹现有纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立起来的,包括:
⏹
(1)根据溶解度的不同,有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法等。
⏹
(2)根据分子大小的差别,有胶过滤(层析)法、超过滤法及超离心法等。
⏹(3)根据电学、解离性质,有吸附(层析)法、离子交换层析法、电泳法以及集层析与电泳之长的聚焦层析法等。
⏹(4)基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的各种亲和分离法等。
⏹(5)利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法。
⏹值得提到的是,在这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作用。
一、根据溶解度不同进行的纯化
⏹1.盐析法
⏹盐析法是古老的、但也是目前仍广泛采用的方法。
⏹盐析法根据的原理是:
球蛋白类在低盐浓度的溶液中,溶解度随盐离子强度升高而增大,表现“盐溶”(saltingin)特性。
但是当盐浓度继续升高,并超过某一上限时,其溶解度又会先后以不同速度下降,分别“盐析(saltingout)”沉淀析出。
盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别而建立的一种纯化方法。
⏹在盐析条件下,蛋白质的溶解度与溶液的离子强度间有如下的关系:
⏹logS=β-Kso·
I
⏹S为蛋白质的溶解度;
I为溶液的离子强度;
β为蛋白质在纯水(I=0)中溶解度S的(外推)对数值,它取决于蛋白质的种类,也与溶液的温度和PH值有关,K称为盐析常数,主要由蛋白质的性质与盐的种类决定
为了获得较好的盐析效果,应控制下述因素:
⏹
(1)pH:
控制盐析pH可以提高纯化效果,如甘油醛-3-磷酸脱氢酶在某一盐浓度下可通过改变pH而达到纯化。
但一般来说,pH可选择的范围不大。
大多数情况,盐析的pH宜接近待纯酶的等电点。
有些情况,酶和杂蛋白能形成某种结合,从而干扰盐析分离。
此时如控制pH〈5或PH〉6,使它们带相同电荷可以减少络合物形成,这样盐析效果常会有些改善。
⏹
(2)盐:
在纯化的最初阶段,盐性质的影响不一定很明显.但是随着酶的纯度提高,盐的特征效应就可能突出出来。
一般地说,Kso越大,效果越好。
实践表明,就阳离子而言,一价盐通常比二价盐有效:
而阴离子则相反,二价盐比一价盐好。
符合这种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵最常用,它的最大优点是:
溶解度大,溶解的温度系数小(0℃,706g/L;
25℃,767g/L),即使是在低温的溶解度范围内,几乎所有蛋白质都能盐析出来。
⏹用硫酸铵进行盐析时,溶液的盐浓度通常以饱和度表示,即以饱和溶液中盐的饱和度为100%,即相当于4mol/L(0℃)进行计算。
调整溶液的盐浓度有两种方式,当蛋白质溶液体积不太大,而要达到的盐浓度又不太高时,为防止加盐过程中产生局部浓度过高,最好添加饱和硫酸铵溶液,加入量可按下式计算:
⏹V=Vo[(S2-S1)/(1-S2)]4.2
⏹V和Vo分别为应加入的硫酸铵饱和溶液体积与蛋白溶液原有体积;
S2和S1为要达到的和原有的硫酸铵饱和度。
浓的硫酸铵溶液的pH通常是4.5~5.5,调节pH可用硫酸或氨水。
⏹测定溶液的pH时,一般应先稀释l0倍左右,然后再用pH试纸或pH计测定。
另一种情况是蛋白质溶液原来体积已经很大,而要达到的盐浓度又很高,此时则以加固体硫酸铵为宜,加入量可通过计算,也可以直接查表。
加固体较为经济,也较方便.但所用的固体应充分研细,并在不断搅拌下缓缓加入,以避免局部过浓,同时要防止泡沫大量生成。
⏹(3)温度:
从酶的稳定性和溶解度而言,盐析温度以控制在4℃为宜;
⏹(4)蛋白质浓度:
这是一个十分重要、而又常被忽视的因素:
它一方面能影响盐析效果的重现性,因为蛋白浓度不同,分级分离范围也往往会发生一些变动;
另一方面,蛋白浓度在100ug/ml以下.盐析沉淀一般很困难,有时甚至根本不能形成沉淀。
在200ug/ml-1mg/ml范围内,沉淀虽能生成,但时间较长,而且回收率往往不高。
为了获得较好的盐析效果,蛋白浓度应在1mg/ml以上。
⏹(5)盐析操作:
盐析沉淀通常至少要近一小时才能完成,沉淀可通过离心或压滤和母液分离。
盐浓度低时,离心比较容易,而过滤较难;
浓度较高时,需要高速离心,但过滤较易。
⏹盐析如果在碱性条件下进行,而盐浓度又很高(譬如大于50%S)时,盐析物常常不易离心沉降,有时还可能出现上浮现象.为使以后的纯化具有较好的重现性,盐析后沉淀中夹带的母液应尽量除尽。
⏹获得盐析沉淀后,可将其溶于适当的缓冲液中,并除去不溶蛋白,这样相当于又一次纯化。
有时也可用不同盐浓度的溶液对沉淀进行分级的溶解。
⏹盐析法的优点是:
简便、安全(大多数蛋白质在高浓度盐溶液中相当稳定)、重现性好。
⏹其缺点是:
分辨率低,纯度提高不显著,同时还常常有脱盐问题。
⏹盐析法的一个发展就是和层析技术相结合形成盐析层析法(saltingoutchromatography).即以琼脂糖等非极性物质为柱层析的支持体,在高盐浓度条件下将样品中的蛋白质盐折吸附下来,然后再梯度地降低盐浓度,使酶和杂蛋白分别洗脱出来》这种技术的优点是纯化量大,重复性好,分辨率较高。
2.有机溶剂沉淀法
⏹此法的原理是,不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。
有机溶剂在这个过程中的主要作用是降低溶液的介电常数,因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比,加入有机溶剂,蛋白质分子间的引力增加,溶解度降低。
有机溶剂的另一作用可能是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。
不过,蛋白质溶解度和有机溶剂浓度之间目前还没有一个可用的关系式。
进行有机溶剂沉淀处理时,应考虑以下因素:
⏹
(1)温度:
这是最重要的因素,因为大多数蛋白质遇到有机溶剂很不稳定.特别是温度较高(例如室温)的情况下,极易变性失效,故操作应在0℃以下进行。
有机溶剂也必须预先冷却到-20℃~-15℃,并在搅拌下缓慢加入。
沉淀析出后应尽快地在低温下离心分离.获得的沉淀还应立即用冷的缓冲液溶解,以降低有机溶剂的浓度。
个别酶对有机溶剂比较不敏感,比较稳定,此时可在较高温度(如室温)下进行操作,以便除去较多的杂蛋白。
⏹
(2)PH:
由于蛋白质处于等电点时溶解度最低,故有机溶剂沉淀也多选在靠近目的酶的等电点pH条件下进行。
例如,“肌肉酶”的分离在pH6.5时效果较好。
pH调整通常选用0.05mol/L的缓冲液。
⏹(3)离子和离子强度:
中性盐在多数情况下能增大蛋白质的溶解度,并能减少变性影响。
在进行有机溶剂的分级沉淀时,如果适当地添加某些中性盐,例如,5%-10%的硫酸铵,往往有助子提高分离效果。
但盐的浓度一般不宜超过0.05mol/L,否则沉淀不好,甚至沉淀全无,同时有机溶剂消耗也多。
⏹在进行有机溶剂沉淀时,也可利用多价阳离子效应,即在向酶溶液加入有机溶剂时,可将溶液的PH调整到略高于目的蛋白质的等电点,使之带有负电荷,然后再添加少量(0.005~0.02mol/L)的多价阳离子,例如Zn2+、pb2+。
等,由于这些离子能和阴离子蛋白质形成络合物,降低其熔解度,从而可减少有机溶剂的用量,同时也可提高分离的分辨效果。
但是.应注意磷酸盐存在的情况下不能用Zn2+以免导致磷酸锌沉淀形成。
⏹(4)有机溶剂:
用于蛋白质纯化的有机溶剂中,丙酮的分离效果最好,引起失效的情况也较少。
除丙酮外,乙醇和甲醇等也常用.有机溶剂浓度通常以百分体积比表示,加入量可按下式计算:
⏹V=Vo(S2-S1)/(S-S2)
⏹其中,V和Vo分别为应加入的有机溶剂体积和原溶液的体积,S、S1和S2分别为待加的有机溶剂、原来溶液中含有的有机溶剂和溶液所要达到的有机溶剂的百分浓度。
⏹有机溶剂沉淀法的优点是:
分辨率高,溶剂容易除去。
缺点是酶在有机溶剂中一般不稳定,易引起变性失效。
3.共沉淀法
⏹这是利用离子型表面活性别如SDS(十二烷基磺酸纳)、非离子型聚合物如聚乙二醇、聚乙烯亚胺以及丹宁酸、硫酸链霉素等,在一定条件下能与蛋白质直接或间接地形成络合物,使蛋白质沉淀析出,然后再用适当方法使需要的酶溶解出来,除去杂蛋白和沉淀剂,从而达
⏹到纯化目的的方法。
⏹以聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEl)纯化限制性内切核酸酶RE.EcoRI为例。
在RE.EcoRI生产菌E.ciliK-121100菌株的超声波破碎离心上清液中,包含着大量的DNA和杂蛋白。
PEI在0.2mol/LKCl的条件下,能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出;
但当KCl的浓度升至0.6mol/L时.虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态,而RE.EcoRI却能重新溶解,因此可将酶和杂蛋白分离开来,使RE.EcoRI得到初步纯化。
4.选择性沉淀法
⏹某些多聚电解质如聚丙烯酸、硫酸糊精以及磷、砷、硅、钨、铜、钒等的杂多酸常能在极低的浓度条件下,选择性地和某种或某类酶结合沉淀析出,其选择性的机制尚不清楚。
以聚丙烯酸(polyacrylicacid,PAA)纯化溶菌酶为例,相对分子质量近9000或近300000的PAA聚合物对某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有选择性沉淀效果,故可用于这些酶的纯化:
5.等电点沉淀法
⏹等电点沉淀根据的原理是,蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小,当其他条件相同时,分子间的引力在蛋白质处于等电点状态最大,因而容易沉淀析出。
由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度,沉淀往往不完全,故而一般很少单独使用,更多的是用作其他沉淀法中一个组合条件。
例如,
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