免疫组织化学操作及注意事项Word文档下载推荐.docx
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无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。
取出容器,室温冷却10~20分钟(注意:
不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。
PBS洗,下接免疫组化染色步骤。
3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法:
切片脱蜡至水。
将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。
切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。
当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后),计时1~2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS洗2分钟×
3,下接免疫组化染色步骤。
3.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:
切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟,然后端离电炉,室温冷却20~30分钟,蒸馏水冲洗,PBS洗,下接免疫组化染色步骤。
4、免疫组化染色步骤:
(以美国ZYMED公司SP试剂盒为例)
石蜡切片脱蜡至水。
3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。
蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行)。
5~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10分钟。
倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
PBS冲洗,5分钟×
3次。
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;
或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;
或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。
显色剂显色(DAB或AEC)。
自来水充分冲洗,复染,封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
m,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×
用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗,5分钟×
2。
冰冻切片4~8
下接免疫组化染色操作步骤。
免疫组化操作规程
(一)、仪器设备
1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;
2)水浴锅
(二)、试剂
1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):
NaCl137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO44.3mmol/L,KH2PO41.4mmol/L。
2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):
柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3)0.5mol/LEDTA缓冲液(pH8.0):
700ml水中溶解186.1gEDTA·
2H2O,用10mmol/LNaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):
在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5)酶消化液:
a、0.1%胰蛋白酶液:
用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。
b、0.4%胃蛋白酶液:
用0.1N的HCl配制。
6)3%甲醇-H2O2溶液:
用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7)封裱剂:
a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合;
b、油和TBS(或PBS)配制。
8)TBS/PBSpH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;
pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。
(三)、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;
2)无水乙醇中浸泡5分钟;
3)95%乙醇中浸泡5分钟;
4)70%乙醇中浸泡5分钟;
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1)抗原热修复
(1)高压热修复在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。
盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。
10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。
适用的抗原有:
AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,ChromograninA,Cyclin,ER,Heatshockprotein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;
胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。
适用于被固定遮避的抗原,其中有:
Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。
3、免疫组织化学染色
SP法
1)脱蜡、水化;
2)PBS洗2~3次各5分钟;
3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟;
4)PBS洗2~3次各5分钟;
5)抗原修复;
6)PBS洗2~3次各5分钟;
7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体。
8)滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10)PBS洗3次各5分钟;
11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时;
12)II抗中可加入0.05%的tween-20。
13)PBS洗3次各5分钟;
14)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度;
15)PBS或自来水冲洗10分钟;
16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;
17)自来水冲洗10~15分钟;
18)脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。
7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色:
DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
14)蒸馏水洗。
苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化非特异性背景染色及其控制方法
一、非特异性染色的识别
常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,坏死组织及固定不良的组织中心处。
表现为弥漫性,均匀性的背景染色。
也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。
二、非特异性染色的原因
1.Ig与Fc受体结合
多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。
由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。
避免方法:
①用以二抗相同种族的正常血清封闭切片;
②用不含Fc段的抗体,但价格贵
(V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化)
2.静电吸附
抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。
①尽量稀释一抗
②降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;
③用去垢剂如triton-100处理切片。
Tween-20等;
3.二抗与组织中的Ig结合
如羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越
明显,如人与猴,兔与豚鼠。
用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。
如人血清。
4.组织中残存醛基与Ig的结合
如醛类固定后未能彻底的冲洗,残流醛基可以和Ig结合。
①彻底冲洗;
②0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗;
5.内源性过氧化物酶
红细胞,粒细胞的含量尤其高,镜下可以识别,不要将其当成阳性结果。
①石蜡切片0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片;
②冰冻切片3%双氧水处理切片5分钟(99:
1)因为未经固定包埋,大部分酶未被破坏;
③对于骨髓涂片
最好用非过氧化物酶标记的抗体
如碱性磷酸酶(AP)
↓
磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料
快兰(fastblue)或快红(fastred)
↓↓
兰色红色
用明胶甘油封片,不能用含二甲苯的封片剂,溶于二甲苯。
6.内源性生物素
以24mg/ml的卵白素封片15分钟;
7.交叉反应
PcAb敏感性高,但特异性稍低,容易出现非特异性染色。
①尽可能稀释抗体;
②尽可能用McAb;
三、抗体最大稀释度的求法
最大稀释度的目的:
1.节约、
2.特异性染色↑、非特异性染色↓(决定其最大稀释度)
棋盘法
如稀释度
1:
501;
1001:
1501;
200
特异性染色++++++++
非特异性染色+++--
免疫组化常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
①确认是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入,是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统是否和一抗匹配,这一点是非常重要的。
比如,如果一抗是兔来源的抗体,二抗一定要用抗兔的二抗来匹配;
或一抗是小鼠的IgM一抗,二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM(不是IgG)二抗。
④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤检查抗体的有效期和保存条件,尤其是标记了酶或荧光素的抗体,现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。
⑥检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦检查色原/底物溶液,最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中,如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物的因素。
需要注意的是,有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完,否则会失效。
⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配,溶液的pH值很重要,与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性,除了考虑上述因素外,还应考虑:
①标本的固定方式,不当的固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
②不适当的抗原修复方式,由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用,必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法,至于使用哪一种方法,应参照生产厂家的说明,同时结合标本的具体情况而定。
③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围,但是由于使用者的标本来自各种组织,处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度测试,找出最佳的使用浓度。
④切片上遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤孵育时切片是否放置水平,否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而标本弱阳性,则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
①是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是,并不是每一种组织均需要进行此步骤,但对于内源性酶或生物素丰富的组织,如肝脏、肾脏等,需考虑此原因。
处理的方法为:
灭活碱性磷酸酶:
最常用的方法是将左旋咪唑(24mg/m1)加入底物液中,并保持pH值在7.6~8.2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶,对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶,可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素:
消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素,以饱和内源性生物素,使之不再有剩余的结合位点。
具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟,PBS清洗15分钟后即可染色。
②是否选择使用了正确的封闭血清。
电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清,用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片,以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白,如牛血清白蛋白也常应用。
另外,取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭,效果也不错。
③所选择的抗体是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④一抗的使用浓度是否过高。
⑤清洗是否充分。
应严格操作规程。
因在缓冲液中含有一定量的盐,这亦有利于减低背景着色,通常0.05mol/lTris—HCl,0.15mol/lNaCl已适用于多数染色方法,溶液内加入吐温20,效果更佳。
特殊标记时,试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥DBA的使用是否正确。
DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色,使用浓缩型DAB试剂盒时,请严格按照说明书标明的滴加顺序操作,注意校正蒸馏水的pH值,以确保实验结果的正确性;
粉剂DAB溶解时,常有一些不溶性颗粒,这些颗粒须经过滤除去,否则可能沉积于切片组织上,产生斑点状着色。
另外,DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上,因此需将DAB保存于避光干燥处,现用现配,临用前加H2O2。
孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦标本染色过程中是否曾经干涸,否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
1、染色过强
原因
解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长
降低抗体滴度(一般指浓缩性抗体)抗体孵育时间:
室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高,孵育温度超过37℃
一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高
显色时间不能超过5-10分钟,以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因
操作过程中冲洗不充分
每步冲洗3×
5
组织中含过氧化物酶未阻断
可再配置新鲜3%H2O2封闭,孵育时间延长
组织中含内源性生物素
正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分
延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
抗体浓度过低,孵育时间过短
提高抗体浓度,孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期
及时更换试剂
操作中,滴加试剂时缓冲液未沥干,致使试剂稀释
每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(但防止切片干燥)
室温太低,低于15℃
若室温低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟(或4℃冰箱过夜)
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过10分钟
4、染色阴性
解决办法
操作步骤错误
重新试验,设立阳性对照
组织中无抗原
设立阳性对照片,以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误
仔细确定一抗与二抗种属无误
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:
无色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。
一、无色片
染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能:
1、真阴性结果:
整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果:
即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种情况:
(1)、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
由此表明:
制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病理医生也起着不可缺少的作用。
(2)、染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;
或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;
或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了过氧化氢。
为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法:
在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。
如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。
这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。
如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。
如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。
反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。
应一一寻找原因。
阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达。
自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。
在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。
另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。
因此,应另外设立一个已知的阳性对照。
这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。
在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。
为了解决这个问题,目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等,其连续切片储备待用,需要时取出一张便可作为阳性对照。
另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照,因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。
一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
设立阳性对照是病理医生的任务或责任,而不是技术员的责任。
病理医生观察了HE切片,了解切片中是否有
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