红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验Word下载.docx

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6.多道可调加样器、单道可调加样器

7.离心管

8.96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板，使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板）

9.200µ

L、1000µ

LTIP头、水槽

表1.流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较

红细胞

火鸡

豚鼠

人“O”型血

终浓度

0.5

孔底部形状

V型

U型

孵育时间

25-30min

45-60min

红细胞沉积形状

细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状

细胞沉积成环状

（四）流感病毒鉴定和抗原分析步骤

1.实验前准备

（1）标准参考抗血清的处理

1）去除血清中的非特异性抑制素

a）所谓抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合。

目前所知道的非特异性抑制素，除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊的非特异性抑制素，还有三种：

α、β和γ。

在HAI试验中，必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净，才能准确地测定出HAI的抗体效价。

常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液（RDE，受体破坏酶的一种）清除法，过碘酸钾清除法等。

b）RDE处理步骤：

用25mL生理盐水稀释RDE；

在1体积血清中加入3体积RDE（如0.1mL血清+0.3mLRDE），37℃水浴16-18h；

56℃水浴30min；

加入6体积生理盐水（在0.4mLRDE和血清混合物中加入0.6mL生理盐水）。

2）去除非特异性凝集素

a）向20体积RDE处理后的血清中加入1体积的纯血球。

b）完全/彻底混匀，在2-8℃孵育，每15min重新混匀一次。

c）1h后，2000转离心5min。

吸出血清上清液。

d）取出一块96孔血凝板，在第一列每孔加入50uLPBS缓冲液,吸出50uL处理好的血清，做2倍稀释，加入50uL红细胞悬液，室温静置30-60min,观察试验结果，如果红细胞沉积，证明血清中非特异性凝集素去除干净（去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致）。

（2）红细胞悬液配制

1）A.S液全称为Alsever氏液。

配制方法为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g、去离子水加至100mL，微热溶解，将pH值调到6.1，8磅20min高压灭菌，4℃贮存备用。

2）将含有红细胞的A.S液，离心5min（火鸡/鸡红细胞1800rpm；

人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm，不同离心机转速稍有不同），弃上清。

3）加入等量的PBS缓冲液洗涤，充分混匀，离心5min（转速同上），弃上清。

PBS缓冲液洗涤三次。

最后一次洗涤后，离心10min（转速同上），弃上清。

4）吸出适当体积的红细胞，用PBS缓冲液配制成工作浓度为1%红细胞悬液。

2.流感毒株HA滴度的测定

（1）在微量血凝板的第2~12列加入50µ

LPBS缓冲液。

（2）在第一列（A1~G1）中加入100µ

L病毒悬液。

（3）H1加入100µ

LPBS，作为红细胞阴性对照。

（4）从第一列各孔吸50µ

L病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀释，最后一列每孔弃去50µ

L。

（5）在每孔中加入50µ

L红细胞悬液，轻拍血凝板，充分混匀。

（6）室温孵育，鸡和火鸡红细胞静置25-30min后观察结果，人“O”型和豚鼠红细胞45-60min后观察结果，并记录。

3.HA试验结果判断

引起全部红细胞凝集为完全凝集，以“+”记录；

只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；

无凝集记录“-”。

血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。

表2.HA滴度判定举例

病毒稀释度

HA滴度

1:

1

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

2048

3

5

6

7

9

10

11

12

A

+

-

B

C

D

E

F

G

≥2048

H

＜1

4.制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原

（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。

进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。

（2）制备4个单位血凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。

如每种血清做8孔稀释，每孔用抗原25µ

L，则测定一份血清需0.2mL抗原。

根据标准抗血清的份数计算出实验所需病毒抗原总量。

（3）其次，计算出病毒稀释度。

用病毒的HA滴度除以8，得到的商即为配置4个血凝单位所需的稀释度。

如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8，则1:

8（1mL病毒液加7mLPBS缓冲液）稀释该病毒即可得到4个血凝单位的抗原。

注：

红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25µ

L病毒液中含有4个血凝单位（等于50µ

L病毒液中含有8个血凝单位）。

表3.所需抗原总量为1600µ

L时，4个血凝单位配置对照表

病毒液（µ

L）

PBS（µ

800

400

1200

200

1400

100

1500

50

1550

25

1575

12.5

1587.5

6.25

1593.75

5.4个血凝单位抗原的复核滴定

（1）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。

操作方法同HA实验步骤。

（2）如果只有前4孔出现凝集，表明每50µ

L病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。

如第5孔也出现凝集，说明每50µ

L病毒含有16个血凝单位，该抗原必须等量稀释。

如只有前3孔凝集，表明每50µ

L病毒仅含4个血凝单位，病毒量需加倍。

此外，4个血凝单位抗原必须每次现用现配。

6.红细胞凝集抑制试验（HAI）

（1）利用HAI方法进行流感病毒的鉴定

红细胞凝集抑制试验（HAI）鉴定未知病毒，每块96孔血凝板可以检测两株未知病毒。

1）在血凝板的第1-5、7-11列每孔加入25µ

LPBS缓冲液，第6和12列每孔加入50µ

LPBS。

然后在A1-A4、A7-A10各孔分别加入：

抗A（H1N1）pdm09流感病毒标准参考血清、抗季节性A（H3N2）流感病毒标准参考血清、抗B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参考血清25µ

L，用多道移液器从A1-A4、A7-A10行每个孔分别取25µ

L，由A至H行做2倍稀释血清，最后一行弃去25µ

2）第1至4各列每孔加入25µ

L4血凝单位待检抗原1,A7至A10各列每孔加入25µ

L4血凝单位待检抗原2。

第5和第11列加入25µ

LPBS缓冲液，作为红细胞对照。

第6和第12列第一孔分别加入50µ

L8血凝单位待检抗原1和2，由A至H行做2倍稀释，最后一行弃去50µ

L，此处做法的目的是HAI实验同时验证所配置4单位抗原的准确性,确保实验结果准确。

a）阳性对照：

将试剂盒中的各型/亚型流感病毒标准参考抗原按照上述步骤进行检测。

3）轻拍，混匀，室温孵育30min。

4）每孔加入50µ

L配置好的红细胞悬液，轻拍混匀，室温静置30-60min，观察血凝抑制实验结果（具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定，详见表1）。

（2）利用HAI方法进行流感病毒的抗原分析

1）验证4血凝单位抗原步骤同以上，如果4血凝单位结果不准确需重新配置，直至回滴结果准确为止，在进行抗原分析时4血凝单位抗原一定要配制准确，保证病毒之间抗原分析结果有可比性。

2）在微量血凝板的第1-11列每孔加入25µ

LPBS缓冲液，第12列每孔加入50µ

LPBS缓冲液。

在第一行（A1-A11）每孔加入25µ

L对应待检流感病毒型/亚型的抗原分析用参考抗血清及阴性对照血清。

3）从第一行（A1-A11）各孔混匀之后吸取25µ

L血清，由第1行至第8行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去25µ

L液体。

4）在微量板的第1-11列每孔加入25μL配制好的4血凝单位抗原，第12列A12孔加入50µ

L配置好的8血凝单位抗原，由第1行至第4行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去50µ

第12列的E、F、G、H孔做红细胞对照，轻拍微量板，室温孵育30min。

5）在微量板的每孔加入50µ

L的红细胞悬液，轻拍微量板，使红细胞与病毒充分混合。

6）室温静置30-60min（具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定，详见表1）。

观察血凝抑制实验结果。

7.结果判读

红细胞凝集抑制效价是指血凝现象完全被抑制时血清的最高稀释度的倒数。

如1:

80稀释的血清孔不出现凝集（凝集现象完全被抑制），1:

160稀释的血清孔出现凝集（凝集现象没有被完全抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。

（1）利用HAI方法进行流感病毒鉴定的结果判断

1）标准参照抗血清对待检抗原的抑制效价≥20才可以算为阳性。

2）待检抗原与标准参照抗血清有交叉抑制，但与一种型/亚型的标准参照抗血清抑制效价大于其他型/亚型参照抗血清4倍以上时，便可以判定为此种亚型的流感病毒。

（2）利用HAI方法进行流感病毒抗原分析的结果判断

1）当待检病毒与参考雪貂抗血清的HAI效价低于参考病毒与参考抗血清自身HAI效价的8倍（含8倍）或以上时，则认为待检病毒是该参考抗血清检测到的低反应株；

反之，当相差8倍以时（不含8倍），则认为待检病毒是参考病毒的类似株。

2）抗原分析试验时，每次都必须同时加入标准参考抗原进行检测，它既是结果判读的依据，也是试验的质控。

确保实验结果准确，结果更具有可比性。

每次阳性对照的血凝抑制效价上下一孔浮动，在试验质控的围，如果超出此围之外本次试验结果不成立，需重复试验。

（五）注意事项

1.红细胞凝集抑制试验必须用4个血凝单位/25µ

L的抗原，抗原必须现用现配。

2.红细胞悬液的配制必须标准化。

3.正确存放试剂，避免反复冻融及污染。

4.冻干的试剂应按照说明溶解，保存。

5.血凝抑制试验包括以下对照：

（1）红细胞对照，用于准确判断读结果的时间，同时排除血球问题引起的错误结果；

（2）阴性对照血清，以防其它非特异性抗体的影响；

（3）阳性对照：

防止非特异性凝集素及抑制素的干扰；

结果判读标准。