中检院送检细胞制剂检定项目SOPWord格式.docx
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系统检测
阴性
厌氧菌及真菌
内毒素
凝胶法
支原体
培养法
逆转录病毒
PERT法检测逆转录酶活性
HIV-1
荧光PCR核酸检测
HBV
HCV
HCMV
EBV
HPV
人细小B19病毒
HHV6/7
PCR核酸检测
HTLV
猪细小病毒
猪细环病毒
猪圆环病毒
牛副流感病毒
牛腺病毒
牛细小病毒
牛腹泻病毒
牛呼肠孤病毒
【生物学活性检查】
诱导分化能力检测
成骨成脂诱导分化染色法
具有成骨成脂诱导分化潜能
成瘤性检测
软琼脂克隆生长试验
无克隆形成
细胞流式检测标准操作程序
1目的:
对细胞表面抗原进行流式鉴定,保证检测的准确性。
2范围:
细胞流式检测的全过程
3责任人:
技术部
4内容
4.1仪器和试剂
4.1.1仪器设备:
流式细胞仪(FACSCaliburTM)、台式离心机、1000µ
L微量移液枪、100µ
L微量移液枪、10µ
L微量移液枪。
4.1.2试剂以及耗材:
FITC单克隆抗体、APC单克隆抗体、PE单克隆抗体、PerCP单克隆抗体、相应的同型对照;
1XPBS;
鞘液专用流式管、枪头。
4.1.3样本准备
4.1.3.1将样本按条码号顺序排列好,每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支,分别标记好单阳管、阴性管、同型对照管和样本检测管。
4.1.3.2各取100µ
L样本加入标记好的流式管中,然后根据流式管标记的信息分别添加对应的抗体。
充分混匀,置4℃冰箱避光孵育30分钟。
4.1.3.5孵育结束以后加入1mlPBS,充分混匀,1200rpm离心5分钟。
4.1.3.7弃上清液,加入300µ
LPBS。
充分混匀,随后上机检测。
4.2仪器开机程序
4.2.1依次打开稳压电源,主电源,流式细胞仪电源,计算机。
4.2.2开启电脑,在出现的密码登录框中,输入BDIS,按Enter。
4.2.3打开鞘液筒抽屉,检查鞘液筒和废液筒存液情况,鞘液筒空则需要加液,废液筒满则取出倒除,检查管路是否有气泡,否则应排除,没有问题以后,打开鞘液压力开关。
4.2.4开机后,仪器预热5min,即可开始进行实验。
4.2.5实验之前,仪器清洗,专用流式管装满双蒸水,放置仪器吸液管下,设备“run+high”情况下,然后PRIME(排空气)模式运行两次。
4.2.6流式细胞仪上样前FAScomp质控分析
4.2.6.1标准微球的制备(标准微球“CalBRITEbeads”保存4度)
三色检测:
管1:
1滴Unlabeled+0.5ml鞘液(或者0.5ml蒸馏水)
管2:
1滴unlabeled+FITC,PE,Percp各一滴+1ml鞘液
四色检测:
1滴unlabed+1滴APC+0.5ml鞘液
1滴unlabed+FITC,PE,Percp,APC各一滴+1ml鞘液
4.2.6.2打开FAScomp软件,在“sighin”窗口下,输入信息,然后“accept”,进入“setup”窗口。
4.2.6.3“setup”窗口下,选择分选模式:
“Lyse/wash”(用于溶血素洗涤样本)(通常选择该模式),“Lyse/Nowash”(用于溶血处理后的免洗样),然后输入CaliBRITEBeads”批号(批号为6位编码,最后一位为大写字母),选择存储文件。
4.2.6.4然后点击“RUN”,进入PMT窗口,在该窗口下,用管1为样品,选择“RUN-/high”。
点击“start”自动调节光电倍增管的电压,屏幕出现闪烁“PMTSsetsuccessfully”,点击“NEXT”。
4.2.6.5在“COMP”窗口下,用“管2”为样品,选择“RUN/HIGH”,点击“START”,可执行自动调节荧光补偿:
FL1-%FL2,FL2-%FL1和FL3-%FL2,屏幕出现“COMPENSATIONSETSUCCESSFULLY”便可点击出“NEXT”。
4.2.6.6在“sens”窗口下,依然用管2为样,点击“start”可自动检测各参数灵敏度。
4.2.6.7在“summaryreport”下得到所有检测的结果。
4.2.6.8质控完成后,移去标准微球管并插上双蒸水流式管,在“summaryreport”状态下,点击“quit”键,或从“filemenu”中选择“quit”退出程序。
4.2.7打开cellquestpro软件,按”common+B”组合键,连接流式细胞仪。
4.2.8从“cytometer”菜单中选择“detectors”(或者键盘“common+1”)、“threshold”(或者“common+2”)、“compensation”(或者键盘“common+3”)、“status”(键“common+4”),将出现各自对应的窗口,将其拖至空白处。
4.2.9确定软件与细胞仪完成连接。
如果有必要,可点击Cytometer视窗,观察软件与细胞仪是否完成连接。
4.2.10完成连接后,在Cytometer视窗下方会显示CytometerConnected。
检视各项试剂液面是否正常。
在Cytometer视窗右下方会显示各项试剂液面高度。
视实验需要补充FACSFlow,倒除废液。
如果视窗下方显示CytometerDisconnected,可尝试重新启动Cellquestpro软件。
4.2.11接着可以开始规划实验挡、或设置仪器。
4.3上样检测
4.3.1在工具板中选择点图,在文件的空白区点击,然后拖动对角线至所需大小,出点图对话框,点击“plottype”,选择“acquisition->
analysis”;
X、Y轴默认为FSC、SSC,然后上阴性管,调节FSC、SSC电压,再设置目标细胞群“region”,该“region”在调节荧光探测器时使用,在工具板中选择多边形“region”,在FSC/SSC散点图上,设淋巴细胞“region”,该“Region”在调节荧光探测器时使用;
在工具板中选择多边形的“Region”,在FSC/SSC点图上,设目标细胞群“region”,在“region”外点击,将拖至空白区。
然后建立FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4点图,选择“G1=R1”,在工具板上选择象限标尺,三个点图上画象限,指定阴性/阳性区域,调节FL1、FL2、FL3、FL4电压,使细胞群调在各点图所在图的左下角,点击“Acquisitioncontrol”窗口中的“pause”,移去阴性对照管。
4.3.2依次上FITC、PE、Percp、APC单阳管,必要时,调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL2-%FL3、FL3-%FL2、FL3-%FL4、FL4-%FL3的补偿,调节完成后,点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”,移去单阳管。
4.3.3插上同型对照管,删除FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4点图,建立FL1、FL2、FL3、FL4直方图,点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”,之后Setup之面方框‘√’去掉,然后点击‘Acquire’,收集10000个细胞,然后同型管图型外阳性区域画直方图Marker,设定Marker左右边界,移去同型对照管。
4.3.4插上样本检测管,点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”,之后Setup之面方框‘√’去掉,然后点击‘Acquire’,收集10000个细胞,结束以后,移去样本管,插上双蒸水管,将仪器处于“standby”状态。
4.3.5分析数据,选中一个图表,点击菜单中stats,选择“HistogramStats”,出现该选中图的数据分析结果,选择Stats菜单下的“EditHistogramStats”,出现对话框,去掉一些不需要的参数,点击OK。
4.3.6数据储存,首先在Cytometer视图菜单下选择InstrumentSetting保存数据条件,然后Files视图菜单下选择saveDocumentas保存数据模板,之后可使用相关软件进行数据分析。
4.4仪器关机程序
4.4.1换上双蒸水管。
4.4.2在High+Run条件下,运行3min,2次,然后PRIME+high进行排空气2次。
4.4.3点选File>
>
Quit退出软件。
关闭细胞仪,关闭电脑。
如有必要,请加入1/10体积
漂白水,再倒掉废液,避免生物性危险。
4.4.4填写运行记录。
5修订记录
序号
版本号
修订内容摘要
修订人/修订日期
支原体培养法检测标准操作程序
规范培养法检测支原体的标准操作程序
细胞产品中支原体的检测
4.1实验试剂耗材
4.1.1仪器:
生物安全柜,二氧化碳培养箱,电动移液器,移液枪
4.1.2耗材:
EP管,200µ
l枪头,5ml移液管,15ml离心管
4.1.3试剂:
支原体培养法检测试剂盒
4.2实验步骤
4.2.1用5ml移液管取细胞培养上清于15ml离心管中备用。
4.2.2取出试剂盒的测试板准备种样本,移液枪吸取100ul培养液加入A1-空白对照孔。
4.2.3将100ul细胞培养上清加到UU-MH培养瓶中,混匀。
4.2.4吸取100ulUU-MH培养瓶中的混合液体分别接种到样本检测的微孔中,所有微孔滴加1-2滴试剂盒中的矿物油。
4.2.5将测试板加盖后置培养箱中35-37℃培养24-48小时,观察结果:
接种标本的培养基培养后,澄清透明不变色为阴性,澄清透明并呈明显红色为阳性。
4.2.6若偶遇培养基变浅红色(即变色不明显),建议延长12~24h培养报结果(可能刚感染支原体,标本中支原体数量过少或受抗生素抑制作用而使变色不明显)。
5记录
5.1试剂盒的支原体鉴定报告单
6修订记录
逆转录病毒PERT法检测标准操作程序
规范质量检验中逆转录病毒PERT法检测标准操作程序
细胞产品中逆转录病毒的检测
4原理
逆转录病毒是一大类含有逆转录酶的RNA病毒,分为肿瘤病毒亚科、慢病毒亚科和泡沫病毒亚科。
逆转录病毒进入宿主细胞后,以RNA为模板逆转录合成双链DNA,DNA被整合酶整合至宿主染色体形成前病毒,建立终生感染并可随宿主细胞分裂传递给子代细胞。
基于这一共同特点,可通过检测逆转录酶活性来检测细胞样品是否被逆转录病毒污染。
以MS2噬菌体RNA为模板,在合适的反应条件下,利用待检细胞的裂解液或者培养液进行逆转录,再以逆转录反应液为模板,以MS2噬菌体基因组特异性引物进行PCR,根据PCR的结果即可判断待检样品是否受逆转录病毒污染。
5内容
5.1实验物品的准备
5.1.1仪器:
Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统
5.1.2试剂:
MS2噬菌体RNA、去RNase水、逆转录酶、2×
EasyTaqDNA聚合酶、DNAMarker、
MS2噬菌体基因组特异性引物、RibonucleaseInhibitor、琼脂糖
5.2实验步骤
5.2.1样品制备收集培养的hUC-MSCs约1X106,加入100μLPBS。
置于-20℃冰冻30min,
然后室温融化,反复冻融三次以裂解细胞,10000g离心10min,取上清液备用。
5.2.2对照设置以逆转录酶为阳性对照,此时逆转录酶体积为1μL,去RNase水的体积相应
变化,保持总反应体系为20μL;
以去RNase水为阴性对照。
5.2.3逆转录体系如下:
成分
体积(μL)
RNase-freewater
11
2.5mMdNTP
4
5×
RTBuffer
1
10mMprimer
0.5
RibonucleaseInhibitor
MS2RNA
2
待检样品
总体积
20
42℃反应30min,85℃加热5min使拟转录酶灭活。
5.2.4PCR体系如下:
2×
EasyTaqDNApolymerase
10
10μMPrimer_F
10μMPrimer_R
逆转录反应液
ddH20
7
PCR程序如下:
过程
温度
时间
预变性
95℃
5min
PCR反应
(35个循环)
94℃
30sec
59℃
72℃
20sec
延伸
1min
5.2.5凝胶电泳
取5μLPCR产物,加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳。
电压为120V,时间为30min。
电泳结束,利用凝胶成像仪拍照。
预期PCR产物阳性对照必须有308bp条带出现,阴性对照必须无任何扩增,否则实验无效。
6记录
6.1《逆转录病毒检测实验记录》
7修订记录
修订人
/修订日期
细胞基因组DNA提取操作标准流程
规范质量检验中从细胞中提取DNA的标准操作
细胞基因组DNA提取
4.1实验物品的准备
4.1.1试剂:
DNA快速提取试剂盒、异丙醇
4.1.2耗材:
10mL移液管、5mL移液管、50mL离心管、10μL&
200μL枪头、1.5mLEP管
4.1.3仪器:
掌上离心机、混匀仪、电热恒温水槽、台式离心机、Nanodrop微型分光光度计
4.2实验步骤
4.2.1提前打开水浴锅,设置为70℃,预热高压的去离子水(溶解DNA用),将细胞沉淀(滴度测定实验准备的新鲜样品或-80℃冻存样品)用180μL的PBS重悬。
4.2.2加入20μL蛋白酶K溶液(用之前震荡混匀离心),充分震荡混匀,瞬离,加入200μL结合液CB,立刻涡旋震荡,充分混匀,70℃水浴锅内放置20min(10min时震荡混匀一次)。
4.2.3瞬离(为避免管盖沾有液体),加入100μL异丙醇,立刻涡旋震荡,充分混匀,此时可能出现絮状沉淀。
4.2.4瞬离(为避免管盖沾有液体),将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)(加之前吹打两下,使之混匀),加入后立即盖好盖子,防止异丙醇挥发,13000rpm,1min,20℃,离心,倒掉收集管中的液体。
4.2.5加入500μL抑制物去除液IR(用之前摇一下混匀),12000rpm,1min,20℃,离心,弃掉废液。
4.2.6加入500μL漂洗液WB(检查已加入无水乙醇),12000rpm,1min,20℃,离心,弃掉废液。
4.2.7加入500μL漂洗液WB(检查已加入无水乙醇),12000rpm,1min,20℃,离心,弃掉废液。
4.2.8将吸附柱AC放回收集管中,13000rpm,2min,20℃,离心,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。
4.2.9取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,打开盖子静置2min,使乙醇完全挥发,如样品较多,晾干2分钟后需盖上所有管盖;
在吸附膜的中间部位加50μL预热过的高压的去离子水,70℃水浴锅中放置5min,13000rpm,1min,20℃,离心。
4.2.10利用Nanodrop检测所提DNA溶液浓度,要求A260/A280在1.8-2.0之间,A260/A230大于2.0。
DNA溶液储存于4℃或-20℃待用。
5.1《内外病毒DNA因子检测记录》
细胞基因组RNA提取操作标准流程
规范质量检验中从细胞中提取RNA的标准操作
细胞内RNA提取
EasyPure®
RNAPurificationkit、70%乙醇、β-巯基乙醇
10μL&
200μL&
1000μL枪头、1.5mLEP管
4.2.1样品处理
收集细胞,离心得到的细胞沉淀,去除上清后,轻弹离心管底部,细胞细胞沉淀检散,加入相应体积的裂解液BB4(每1mlBB4加入10ulβ-巯基乙醇,现配现用),剧烈涡旋,直至细胞沉淀分散均匀。
(注意:
当细胞量《1*10^6,BB4用量0.3ml;
当细胞量1*10^6《5*10^6,BB4用量0.6ml)
4.2.2均质化处理
用RNase-free的针管反复吹吸5-10次,使溶液合均匀质化,然后室温12000g离心5min,吸上清于一RNase-free的离心管中。
4.2.3RNA提取
4.2.3.1向上清中加入1倍体积的70%乙醇,涡旋彻底混匀,分散沉淀,将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中,12000g离心30s,弃掉流出液。
4.2.3.2向离心柱中加入500ulCB4,室温12000g离心30s,弃掉流出液。
4.2.3.3去除基因组:
向离心柱中英加入80ul的DNaseI工作液,室温放置15min,向离心柱中再次加入500ulCB4,室温12000g离心30s,弃掉流出液。
4.2.3.4离心柱中加入500ulWB4,室温12000g离心30s,弃掉流出液;
重复该步骤一次。
4.2.3.5室温12000g离心2min,彻底去除残留的乙醇,在室温敞开静置数分钟彻底晾干离心柱。
4.2.3.6将离心柱转入一个新的1.5mlRNase-free的离心管中,并向离心柱中英加入30-100ul37℃预温的RNase-freeWater,室温静置1min,然后室温12000g离心2min,洗脱RNA。
4.2.3.7利用Nanodrop检测所提RNA溶液浓度。
RNA溶液储存于-20℃或-80℃保存待用。
5.1《内外病毒RNA因子检测记录》
病毒PCR法检测标准操作程序Ⅰ
规范质量检验中用PCR法检测病毒核酸的标准操作程序
细胞产品中内外病毒DNA的检测
4.1.1仪器
Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统
4.1.2试剂
猪源病毒PCR试剂盒、HHV6/7试剂盒、牛细小病毒/牛腺病毒PCR试剂盒、琼脂糖
4.2.1样品DNA的制备
用自选方法提取纯化样品的DNA,并检测DNA浓度,要求A260/A280在1.8-2.0之间;
A260/A230大于2。
4.2.2对照设置
将试剂盒自带的阳性对照稀释1000倍,稀释后浓度为105拷贝/μL,作为阳性对照。
以ddH20作为阴性对照。
4.2.3PCR扩增
PCR体系如下:
PCRMagicMix3.0
病毒PCR引物混合液
DNA模板
15sec
55℃
最后延伸
10min
4.2.4电泳检测
取5μLPCR产物,加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳。
预期PCR产物阳性对照有相应的条带出现,阴性对照无任何扩增条带,否则实验无效。
病毒PCR法检测标准操作程序Ⅱ
细胞产品中病毒RNA的检测
牛病毒性腹泻病毒/牛副流感/牛呼肠弧病毒PCR试剂盒、琼脂糖
4.2.1样品RNA的制备
用自选方法提取纯化样品的RNA,并检测RNA浓度.
4.2.2RNA质量鉴定
浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳,电泳条件条件为:
电压120V,时间30min.电泳结果要求28s和18s条带清晰,且亮度符合2:
1.表明RNA完整。
4.2.3样品检测
4.2.3.1逆转录
逆转录体系:
试剂
用量(μL)
6.5
dNTP(2.5mMeach)
RTbuffer
BVDV_F/BVDV_R(10μM)a
各0.5
RibonucleaseInhibitor(50U/μL)
RNAb
3
ReverseTranscriptase
Total
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- 中检院 送检 细胞 制剂 检定 项目 SOP