脓汁和粪便标本中病原菌检测实验报告二Word文件下载.docx
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称取一定量的肉汤培养基,至于三角烧瓶中,加入适量的蒸馏水,煮沸一次,趁热分装;
称取一定量的营养琼脂培养基,至于三角烧瓶中,加入适量的蒸馏水,煮沸三次(煮至刚刚冒泡,立刻置于台面,半分钟后再煮),使完全溶解,趁热分装。
(平板培养基:
以无菌操作,倾注平皿10ml,琼脂完全凝固后,平板倒放,4℃冰箱保存备用。
斜面培养基:
培养基趁热斜放,培基不超过试管长度的2/3,琼脂凝固以后,4℃冰箱保存备用。
)贴上标签后灭菌使用。
2空气与人体体表细菌学检查
根据空气中细菌气溶胶粒子,在地心引力的作用下,以垂直的自然方式沉降到培养基表面,培养以后,计数菌落形成单位(CFU),了解空气的污染情况。
平板盖打开,盖朝下放在平板旁,琼脂平板暴露15分钟即可。
在普通平板上接种手指上的细菌。
第1格为洗手前,第2格为洗手后,第3格为消毒后,第4格空白对照。
3细菌分离培养
接种前,接种环烧灼灭菌。
取标本在平板表面上方密集涂布5~10mm²
。
烧掉接种环上多余的标本。
冷却后,应用分区划线分离法,将脓汁标本接种于营养琼脂平板(2份),粪便标本接种于伊红美蓝平板(2份)。
接种完毕后,接种环烧灼灭菌。
将平板倒置37℃培养18~24h,观察结果。
4细菌的群体生长特性观察和纯化培养
2
观察细菌分离培养物中菌落特征,并记录。
②选取平板上相同的菌落数多的,典型的,容易挑取的单菌落。
通过无菌操作轻刮取菌,接种于斜面培养基中。
接种完毕,灼烧接种环,斜面培养基置于37℃培养过夜。
5细菌的个体形态特征的观察
2斜面培养物的观察
②革兰氏染色:
取洁净载玻片,用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上,挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀。
待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合,使标本固定,进行染色。
结晶紫染液初染1分钟后水洗,芦戈氏碘液媒染一分钟后水洗,95%酒精脱色20-30s,水洗,稀释复红复染一分钟后水洗。
待标本晾干后滴加香柏油,油镜下观察。
③通过无菌操作,分别在斜面培养物中挑取菌苔少许,立即移入肉汤培养基管中,在接近液面的管壁上轻轻研磨,并沾取少量肉汤调和,使菌液混合语培养基中,混匀。
接种完毕,试管口通过火焰2-3次灭菌,塞好棉塞。
接种环灼烧后放下。
6细菌的糖发酵实验
通过无菌操作,用灭菌接种针刮取新鲜细菌培养物少许,分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内。
将微量管平放在平皿内,37℃培养过夜后观察结果。
7血浆凝固酶实验
取干净玻片一张,在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴,生理盐水1滴。
将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌冷却后,取细菌新鲜培养物少许,在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液。
用灭菌接种环取细菌悬液1环,或挑取细菌培养物少许,在兔血浆中轻轻抹匀。
稍等片刻,观察结果。
8血清学实验
取洁净的载玻片一张,将磨面近端设为对照区,滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区,滴加福氏志贺菌诊断血清15ul,用接种环分别取粉红色菌苔,研磨于盐水或血清内,混合均匀。
载玻片来回倾侧,让菌液充分混匀,凝集速度更快、结果更清楚。
9半固体穿刺培养
接种针灭菌处理后挑取菌苔少许,垂直刺入半固体培养基中心,可刺达近底管处,但不要到达管底,然后沿原路退出。
接种完毕,试管口迅速通过火焰2-3次灭菌,塞好棉塞。
接种针灼烧后放下。
37℃培养过夜。
10细菌药物敏感性试验
接种环取菌液在平板培养基表面,拉出2条细菌接种线,使呈“十字形”。
平板密集划线接种细菌。
设计三点,呈等边三角距离,点距离平皿边缘约15mm。
作标记:
青、链、庆。
镊子火焰消毒,夹取相应的药物纸片,平贴在已设定的位置上,按压,镊子火焰灭菌。
37℃18~24小时培养,观察结果。
四、实验结果及分析
1、空气与人体体表细菌学检查
(1)空气:
菌落数:
16个,采集地点:
厕所。
由CFU/m3=50,000N÷
AT≈86N(直径7cm平板)实验室空气细菌标准。
N:
平板上的菌落数,A:
平板面积(38.5cm2),T:
采样时间(15分钟)
分析讨论:
在课堂上,和其他组比较发现,微生物实验室中空气细菌是比较多的,而厕所反而菌落少,可能是因为实验室是封闭的,而且人流量大,故而空气中的细菌也就多了,厕所人流量少,反而干净。
(2)人体体表:
手指皮肤的细菌学检查我们发现无论是标准还是普通洗手后,平板上菌落的数量与洗手前的是差不多的,甚至还多些,而消毒后的我们组两个同学的没发现菌落,空白对照出有两个同学的都有一个菌苔洗前细菌种类多,洗后细菌种类少。
对于普通洗手的同学来说,由于暂驻细菌未能完全清洗干净,而常驻细菌又暴露了,故洗手后测到的细菌反而多了,对于标准洗手的同学来说,暂驻细菌可能是完全洗净,但暴露的常驻细菌可能与暂驻细菌相当或比之还多,因此出现该结果。
而用碘酒消毒后未发现菌落,说明碘酒消毒可以消毒彻底。
而空白对照说明我们手指皮肤上的细菌比空气中的多。
2细菌分离培养
浓汁标本平板粪便标本平板
脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落,圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、不透明。
粪便标本在伊红美蓝平板上,有紫黑色、淡粉红色两种菌落。
紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明。
淡粉红色菌落半透明。
用伊红美蓝平板,从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落,显微镜下均为G-杆菌,散在排列。
紫黑色金属光泽的产生是因为乳糖被分解产酸,酸使伊红美和蓝紫结合,产生紫黑金属光泽菌落。
紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。
致病菌不能分解乳糖,菌落呈现伊红的颜色。
粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
3细菌的个体形态特征的观察
G-杆菌G+球菌
用伊红美蓝平板,从粪便标本分离,获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
显微镜下,均为G-杆菌,散在排列。
用普通平板,从脓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落,这两株细菌,显微镜油镜下均为G+球菌,排列不规则,呈葡萄串状。
4细菌的糖发酵实验
粪便标本分离菌糖发酵试验中,紫黑色菌落菌种的葡萄糖和乳糖微量发酵管都为黄色,有气体产生;
粉红色菌落菌种的葡萄糖微量发酵管为黄色,不产气,乳糖微量发酵管无明显变化。
5血浆凝固酶实验
脓汁标本分离菌血浆凝固酶实验中,黄色菌种菌液出现明显凝块,实验结果为阳性;
白色菌种未出现凝集反应,实验结果为阴性。
通过血浆凝固酶实验,黄色菌种实验结果为阳性,为致病菌。
6血清学实验
玻片凝集试验中,粉红色菌落菌种在福氏志贺菌诊断血清中出现片状凝集现象,实验结果为阳性;
而在生理盐水中未出现凝集现象。
通过血清学实验,粉红色菌落菌种与福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应,确定其为福氏志贺菌。
7半固体穿刺培养
半固体培养基中,紫黑色菌落菌种扩散生长,培养基呈扩散云雾混沌状态;
粉红色菌落菌种沿穿刺线生长,穿刺线边缘整齐,周围培养基清澈透明。
半固体动力试验表明紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性,有鞭毛;
粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性,无鞭毛。
8细菌药物敏感性试验
白色细菌平板黄色细菌平板
粉红色菌种平板紫黑色菌种平板
各菌落抑菌圈直径
青霉素
头孢曲松
庆大霉素
黄色菌种
42mm
25mm
30mm
白色菌种
22mm
40mm
紫黑色菌种
无作用
37mm
26mm
粉红色菌种
36mm
38mm
由于青霉素针对的是革兰氏阳性细菌,因此对白色菌落和黄色菌落是高度敏感的,而头孢曲松和庆大霉素都是广谱抗生素,对革兰氏阴性和阳性细菌都较为敏感,因此对四种菌落都有较好的抑菌作用,这也说明我们不能单从这些细菌的抗药敏性实验中得出细菌的种属,应结合多个生化反应进行判断。
五、实验综合讨论
1、用普通平板,从脓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落,油镜下均为G+球菌,排列不规则,呈葡萄串状,是典型的葡萄球菌。
结合菌落色素,这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶,可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块。
通过血浆凝固酶实验,金黄色葡萄球菌实验结果阳性,为致病菌。
从形态上不能鉴别是什么细菌。
经糖发酵试验(紫黑色菌落菌种分解葡萄糖和乳糖,产酸产气;
粉红色菌落菌种只能分解葡萄糖,产酸不产气)半固体动力试验(紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性,有鞭毛;
粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性,无鞭毛)。
对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征,判定它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。
通过血清学实验,粉红色菌落菌种与福氏志贺菌诊断血清发生凝集反应,进一步确定其为福氏志贺菌。
肠道杆菌科各菌属生化反应鉴别表
葡萄糖
乳糖
麦芽糖
甘露醇
蔗糖
半固体
埃希菌属
⊕
√
+
志贺菌属
+/-
-/+
-
沙门菌属
⊕/+
霍乱弧菌
变形杆菌属
注:
+产酸或阳性,⊕产酸产气,-阴性,+/-多数阳性,-/+多数阴性√不确定。
常见肠道感染细菌主要生化反应特征
大肠埃希菌
福氏志贺菌
—
伤寒沙门菌
幽门螺杆菌
不分解糖类
变形杆菌
2、对照常用药敏试验纸片判断标准,金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素、庆大霉素、链霉素均敏感。
大肠埃希菌对青霉素耐药,庆大霉素、链霉素敏感,福氏志贺菌对青霉素耐药,对庆大霉素、链霉素敏感。
可得结论G+球菌对青霉素和链霉素敏感。
G-杆菌对青霉素耐药,对链霉素敏感。
G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。
常用药敏试验纸片判断标准
抗菌药物
纸片含药量
抑菌圈直径(mm)
耐药
中度敏感
敏感
青霉素G(葡萄球菌)
10单位
≤28
≥29
链霉素
10微克
≤11
12~14
≥15
≤12
13~14
四环素
30微克
≤14
15~18
≥19
氯霉素
13~17
≥18
磺胺
300微克
13~16
≥17
结果:
综上所述,脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌,白色菌落为白色葡萄球菌,致病菌为金黄色葡萄球菌;
粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌,粉红菌落为福氏志贺菌,致病菌为福氏志贺菌。
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- 粪便 标本 病原菌 检测 实验 报告