多肽合成技术资料讲解Word格式文档下载.docx

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多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。

因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。

合成中需要进行保护的氨基酸包括：

Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。

需要进行保护的基团：

羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。

其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。

当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。

表1常见3种氨基脱除条件

TFA

HBr/TFA

H2/Pd-C

Piperidine/DMF

Boc

y

n

Z

Fmoc

图1常见3种氨基保护基结构

氨基酸侧链保护基团非常多，同一个侧链有多种不同的保护基，可以在不同的条件下选择性的脱除，这点在环肽以及多肽修饰上具有很重要的意义。

而且侧链保护基和选择的合成方法有密切的关系，液相和固相不一样，固相中BOC和FMOC策略也不一样，从某种意义上看，多肽化学就是氨基酸保护基的灵活运用与搭配。

关于侧链保护基的使用，请参考王德心的《固相有机合成——原理及应用指南》第四章，我们这里主要介绍Cys，Lys，Asp的几种保护基及其脱除方法。

Cys最常见的保护基有三种，Trt，Acm，Mob，这三个保护基可以完成多对二硫键多肽的合成。

Lys最常见的保护基有：

Boc，Fmoc，Trt，Dde，Allyl，这对于固相合成环肽提供了很多正交的保护策略。

Asp最常见的保护基有：

Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同样也提供了多种正交的保护策略。

表2巯基常见保护基

简称

结构

脱除条件

Trt

TFA，HCl/HOAc，I2/MeOH

Acm

I2/MeOH，Hg2+

Mob

HF，TFMSA，Hg2+

表3氨基常见保护基

TFA，HOAc，HCOOH

HCl/HOAc，TFA/DCM

Pip/DMF，NaOH/MeOH

Dde

H2NNH2/DMF

Allyl

Pd（Ph3P）4，吗啉/THF

表3羧基常见保护基

Otbu

OBzl

H2/Pd，HF，TFMSA

OMe

NaOH/MeOH

OAll

OFm

Pip/DMF，DBU/DMF

1.2．多肽缩合试剂

目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，最早使用的是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反应试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被后来的缩合试剂取代，按照其结构可以分为两种：

缩合试剂主要有：

碳二亚胺型，鎓盐型（Uronium）。

1.2.1．碳二亚胺型

主要包括：

DCC，DIC，EDC.HCl等。

采用DCC进行反应，由于反应中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，产生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其价格便宜，在液相合成中，可以通过过滤除去，应用仍然相当广泛。

EDC.HCl因为其水溶解性的特点，在多肽与蛋白的连接中使用比较多，而且也相当成功。

但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点，就是如果单独使用，会有比较多的副反应，但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt，HOAt等试剂，可以将其副反应控制在很低的范围。

其反应机理如下：

图2 

DIC活化反应机理

1.2.2．鎓盐型

鎓盐型缩合试剂反应活性高，速度快，现在使用非常广泛，主要包括：

HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。

该试剂使用过程中需要添加有机碱，如，二异丙基乙胺（DIEA），N-甲基吗啉（NMM），该试剂加入后，才能活化氨基酸。

图3 

TBTU活化反应机理

1.3．多肽合成方法比较

1.3.1．液相多肽合成（solutionphasesynthesis）

液相多肽合成现在仍然广泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大，合成成本低的显著优点，而且由于是在均相中进行反应，可以选择的反应条件更加丰富，象一些催化氢化，碱性水解等条件，都可以使用，这在固相中，使用却由于反应效率低，以及副反应等原因，无法应用。

液相多肽合成中主要采用BOC和Z两种反应策略。

图4液相合成Glu-Trp

1.3.2．固相多肽合成

图5 

FMOC固相合成Glu-Trp

固相多肽合成现在使用的主要有两种策略：

BOC和FMOC两种。

BOC方法合成过程中，需要反复使用TFA脱BOC，而且在最后从树脂上切割下来需要使用HF，由于HF必须使用专门的仪器进行操作，而且切割过程中容易产生副反应，因此现在使用受到实验条件限制，使用也逐渐减少。

FMOC方法反应条件温和，在一般的实验条件下就可以进行合成，因此，也得到了非常广泛的应用。

1.3.2.1．固相合成中常用树脂

固相合成中树脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交联度在1-2%之间，现在使用的大多是1%，因为这种交联度下，树脂在DMF，DCM中具有很好的溶胀性能，立体上是一个空间网状结构，反应物分子可以在树脂内部自由移动。

树脂中最关键的部分是连接手臂，它一端连接在树脂上，一端作为反应位点。

目前广泛使用的树脂有：

PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。

其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因为其对酸非常稳定，需要在HF，TFMSA等强酸条件下才能够切割下来。

图6 

固相合成常用树脂

1.3.2.2．茚三酮检测

固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。

Kaiser试剂包括：

A，6%茚三酮的乙醇溶液

B，80%苯酚的乙醇溶液

C，2%0.001MKCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。

检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。

还有其它检测游离氨基的方法：

三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等。

图7茚三酮检测原理

1.3.2.3．固相合成切割方法

固相合成完成之后，必须选择合适的切割试剂将多肽从树脂上切割下来，然后经过冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，经过HPLC分离纯化，冷冻干燥得到最后产品。

由于选择的树脂不同，氨基酸序列不同，在切割时候，选择的切割方法也不完全相同，一般都是选择酸性条件下切割的条件，对于PAM，MBHA树脂，一般采用HF切割，切割过程中需要添加对甲苯酚，对巯基苯酚，苯甲醚等试剂。

而对于Wang，Rink-Amide，Trt树脂，一般采用TFA切割，切割过程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三异丙基硅烷，苯酚等。

这些添加试剂主要作为碳正离子俘获试剂使用，目的是俘获切割反应过程中生成的碳正离子，减少这些碳正离子对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应，比较容易产生副反应的氨基酸有：

Trp，Tyr。

切割试剂用量一般10-15ml/g树脂。

常用的切割配比：

HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反应一般是在室温条件下2h-4h。

1.3.3．多肽合成中主要问题

1.3.3.1．消旋及其反应机理

多肽合成过程中，部分氨基酸在活化的过程中会导致不同程度的消旋，特别容易消旋的氨基酸有：

Cys，His，Phe，当然这些消旋化还和溶剂，温度以及合成中的有机碱等因素有关。

对于这些氨基酸，可以通过采用高效缩合试剂，减少反应时间，可以减少消旋的比例，一般条件选择适当，消旋化都可以控制在5%以内。

消旋反应机理如下：

图8消旋反应机理

1.3.3.2．二酮哌嗪（DKP）反应

DKP副反应出现在FMOC-Wang树脂合成过程中，主要出现在第一个氨基酸为Pro的时候，当第二个氨基酸脱FMOC的时候，α-氨基被游离出来之后，立即对Wang树脂的苄酯键进行分子内胺解，生成六元环二酮哌嗪衍生物，同时从Wang树脂上释放出来，导致反应终止。

该反应非常迅速，文献报道采用50%Pip/DMF，脱1min，4min的条件，但是我们实验证明在多数情况下，即使是1min左右反应就超过了20%。

因此一般在末端第一个氨基酸为Pro的时候，建议采用2-Cl-Trt树脂合成，由于该树脂巨大的空间阻力，可以完全消除该副反应。

这个副反应在BOC策略合成过程中，却可以完全避免，因为BOC在使用TFA脱除后，使氨基以TFA盐的形式存在，从而失去了亲核性，不能进攻苄酯键。

图9 

DKP反应机理

1.3.3.3．困难序列多肽合成

固相多肽合成中也经常遇到多肽合成失败或合成效率很低的问题，这里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因为有些多肽序列在树脂上形成β-折叠，改变了树脂的溶胀性能，还有可能将反应的活性位点埋藏在树脂里面，这样使得反应很难进行，目前报道使用的主要方法有：

∙使用混合溶剂，DMSO/DMF，6N胍啶/DMF溶液

∙提高反应温度，或采用微波方法

∙使用高离液盐，LiCl，NaClO4等。

∙使用溶胀性能更好的PEG-PS树脂，同时减少树脂担载量（0.05-0.2mmol/g）

1.4．合成多肽分析鉴定方法

多肽的分析鉴定方法有多肽一级结构，二级结构鉴定，多肽一级结构包括：

质谱分析，氨基酸组成分析，氨基酸序列分析。

二级结构包括：

圆二色谱（CD），NMR，X-衍射等方法。

1.4.1．纯度分析

多肽的纯度分析，一般都采用HPLC进行分析，选择RP-C18，粒径5μm，孔径300A，4.6×

150mm，流动相：

A，0.1%TFA/H2O；

B，0.1%TFA/ACN，洗脱梯度，5%B--65%B，时间30min。

也有些多肽，特别是短肽，由于亲水性强，在C18上保留很弱，需要改变条件，这里主要有两种方法：

一个改变分析梯度，可以将起始梯度改为2%，等度或小梯度洗脱；

另外一个方法是在流动相中加入强离子对试剂，如七氟丁酸，十八烷基磺酸钠等。

1.4.2．一级结构分析

1.4.2.1．质谱分析

质谱分析的目的主要是确证分子量，当然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是这个需要比较全的数据库作为基础，分析才能比较准确。

由于多肽性质不稳定，需要采用软电离技术，目前多肽分析主要使用了电喷雾（ESI-MS），基质辅助激光解吸（MALDI-MS）。

其中ESI-MS通常会给出多电荷峰，电荷数目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的数目有关，因此，经常给出了双电荷，三电荷等离子峰。

MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情况下很少带多电荷，因此数据直接对应了分子离子峰，容易分析。

此外，通常在分析长肽或蛋白过程中，需要添加NH4，Na，K等离子，提高灵敏度，所以一般在MS中出现一组峰，分别对应：

（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。

1.4.2.2．氨基酸组成分析

氨基酸组成分析一般需要产品的纯度较高，它可以给出多肽中氨基酸的种类，数目。

分析过程首先通过酸水解破坏肽键，典型酸水解的条件是：

真空条件下，110℃，用6M盐酸水解16至72小时。

酸水解虽然很有用，但酸水解条件下不能获得完整的氨基酸分析，因为天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键，用于切断蛋白质肽键的酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸，谷氨酰胺转换为谷氨酸。

由于水解温度比较高，色氨酸的吲哚环容易被空气氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚环也几乎都被破坏了。

因此蛋白质的色氨酸含量往往是通过它的紫外吸收光谱估计的，也可以通过碱水解分析色氨酸的含量。

半胱氨酸在酸水解中也不能精确测定，要精确测量需要在蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。

1.4.2.3．氨基酸序列分析

氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。

首先使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。

然后PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。

接下来将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。

萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。

留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。

1.4.3．二级结构分析

1.4.3.1．圆二色谱（CD）

圆二色谱是一种特殊的吸收谱，它通过测量蛋白质等生物大分子的圆二色光谱，从而得到生物大分子的二级结构，简单、快捷，广泛应用在蛋白质折叠，蛋白质构象研究，酶动力学等领域。

圆二色谱紫外区段（190-240nm），主要生色团是肽链，这一波长范围的CD谱包含了生物大分子主链构象的信息。

α-螺旋构象的CD谱在222nm、208nm处呈负峰，在190nm附近有一正峰。

β-折叠构象的CD谱，在217-218nm处有一负峰，在195-198nm处有一强的正峰。

无规则卷曲构象的CD谱在198nm附近有一负峰，在220nm附近有一小而宽的正峰。

1.4.3.2．核磁共振（NMR）

随着二维、三维以及四维NMR的应用，分子生物学、计算机处理技术的发展，使NMR逐渐成为大分子结构物质分析的主要方法之一。

NMR可用于确定氨基酸序列、分布以及构象。

目前，NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用的，分析结果快速准确。

1.4.3.3．X-衍射

X-衍射可获得有关化合物晶型的直接信息，而且可以判断相对与绝对构型。

∙多肽标记及修饰

目前多肽标记及修饰的内容非常多，广泛应用在多肽药物，多肽生物学，多肽抗体以及多肽试剂的研究中。

目前应用广泛的有：

非放射性核素标记（C13，H2），荧光标记（FAM，FITC），生物素标记，磷酸化修饰等。

2.1．非放射性核素标记

目前在非放射性核素标记中，使用广泛的仍然是C13，H2，因为其使用安全，放射性小。

现在有比较完全的非放射性标记的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法将标记好的氨基酸直接连接到多肽上。

2.2．荧光标记

荧光标记由于没有放射性，实验操作简单。

因此，目前在生物学研究中荧光标记应用非常广泛，荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系，对于有游离羧基的采用的方法与接肽反应相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。

但是对于FITC标记，需要在连接FITC前，增加一个氨基己酸，避免在切割的过程中被TFA切割掉。

2.3．生物素标记

生物素-亲合素系统（biotin-avidinsystem，BAS），是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。

由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。

主要有用于标记多肽氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）和生物素对硝基酚酯（pBNP），其中以BNHS最常用，当然，也可以直接使用生物素也可以标记，因为其结构上有个游离的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法缩合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶剂增加溶解度。

2.4．磷酸肽合成

磷酸肽在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。

目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。

磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或长肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱除。

后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。

∙蛋白结构与功能模拟多肽

多肽在与蛋白受体结合发挥功能的时候，总是先折叠出某些特殊的结构，多肽类似物合成主要是为了模拟这些结构，保持或提高生物活性，同时也为了改变多肽的稳定性，提高其抗酶解能力。

3.1．α-螺旋多肽

α-螺旋是蛋白结构中最为普通的一种，但是一般多肽在溶液中大多是无规卷曲的，目前使用最多的方法是多肽保持α-螺旋结构就是在多肽表面通过共价键将处在α-螺旋结构的两个氨基酸连接起来，选择的位点（i，i+4或i，i+7），选择的化学键包括：

二硫键，硫醚键，酰胺键，烯烃键（RCM）等方法。

3.1.1．二硫键

二硫键广泛存在与蛋白结构中，对稳定蛋白结构具有非常重要的意义，二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基，经氧化形成。

形成二硫键的方法很多：

空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。

二硫键的合成过程，可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。

3.1.2．硫醚键

硫醚键的形成可以通过序列中的Lys，将溴乙酸连接到Lys的侧链氨基上，利用其和巯基的特异性反应，反应在缓冲溶液中进行，迅速高效。

3.1.3．酰胺键

多肽的内酰胺环肽的合成一般是利用Lys，Asp（Glu）的选择性保护，在固相上直接环化。

BOC策略中可以采用BOC-Lys（Fmoc），BOC-Asp（OFm），FMOC策略中可以采用FMOC-Lys（Aloc），FMOC-Asp（Allyl）。

对于首尾环肽，还可以先合成保护的多肽，然后在液相中环化生成目标多肽。

3.1.4．烯烃键（RCM）

RCM反应是一个过渡金属催化反应，其反应中使用催化剂：

（Cy3P）2Cl2Ru=CHPh，可以催化烯烃环化，过程中脱去一分子乙烯。

图10 

固相RCM反应

该反应也可以在固相树脂上直接环化,反应条件：

15-25%（Cy3P）2Cl2Ru=CHPhDCM,60-80℃，24-48h。

3.2．TASP（template-assembledsyntheticpeptide）多肽

瑞士Basel大学的化学家首次提出TASP的概念，他们利用具有“发夹”结构的肽链作为模板，然后将具有α-螺旋结构的多肽直接连接到模板上，模拟蛋白质的高级结构。

3.3．长肽或蛋白合成

3.3.1．FMOC-tbu片段缩合方法

FMOC-tbu片段缩合方法在合成长肽以及蛋白上面运用非常广泛，其合成过程首先是合成保护性肽片段，经过纯化后，将几个片段在液相或固相上组装起来。

使用本方法主要注意几个方面：

片段的选择，片段的合成与纯化，片段缩合方法。

片段选择要考虑到片段连接反应时间长，容易导致消旋，故片段的C末端最好选择Gly，Pro。

合成的片段一般需要经过C4，C8等纯化，对于溶解性很差的多肽，可以采用硅胶柱层析方法进行纯化。

由于片段的分子大，在树脂内移动速度慢，故反应时间一般都很长，而且反应过程中与片段浓度关系很大，溶解的时候，尽量提高