芽孢菌剂在发酵废水中的应用Word文件下载.docx

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2.5.4生物量的测定方法-13-

2.5.5数据处理方法-13-

第三章结果与分析-13-

3.1添加蜡样芽孢杆菌菌粉对发酵废水净化的影响-13-

3.2添加蜡样芽孢杆菌活化菌体对发酵废水净化的影响-15-

3.2.1添加活化后的菌体对发酵废水净化的影响-15-

3.2.2减少装液量，增加溶氧量对发酵废水净化的影响-17-

3.2.3提高摇床转速，增加溶氧量对发酵废水净化的影响-20-

3.2.4重复验证增加溶氧量对发酵废水净化的影响-23-

第四章结论和展望-25-

4.1结论-25-

4.2展望-28-

参考文献-29-

致谢-30-

摘要

本研究，探究蜡样芽孢杆菌在发酵废水处理中的应用效果。

试验水样，取自青岛根源生物技术有限公司平度分公司酶制剂生产的发酵废水，试验设置3个空白对照组和3个投加蜡样芽孢杆菌菌剂的处理试验组，两组水样在同条件下摇床振荡培养，每天对水样的pH值、氨氮浓度和COD浓度等指标进行检测，观察两组水样的pH值变化、氨氮浓度变化和COD浓度变化的情况。

经SPSS17.0统计软件对测定的数据作单因素方差分析，结果表明：

在摇床转速150r/min，装液量为100mL溶氧量充足的情况下，每天两组试验水样的pH值变化趋势和幅度基本一致，两组之间P>

0.05不存在显著性差异，故蜡样芽孢杆菌对该厂发酵废水的pH值变化并没有显著的影响；

每天两组试验水样的氨氮浓度变化趋势都是下降，处理组的下降幅度更大一些，从第2天开始两组之间P<

0.05存在显著性差异，故蜡样芽孢杆菌对该厂发酵废水中氨氮浓度的降低具有一定的功效；

每天两组试验水样的COD浓度变化，从第2天开始两组之间P<

0.05，故蜡样芽孢杆菌对该厂发酵废水中的COD浓度的变化也有一定的有益作用效果。

最终可以得出结论，蜡样芽孢杆菌对该厂发酵废水的净化处理具有比较积极的有益作用。

关键词：

氨氮芽孢杆菌pH值化学需氧量

ABSTRACT

ThisstudywastoexploretheeffectofBacilluscereusinfermentationwastewatertreat-mentapplication.Testwatersamples,takenfromtheQingdaoGenyuanofBiotech-nologyCo.,Ltd.thePingduBranchenzymepreparationproducedbyfermentationwastewatertest.set3blankcontrolgroupandthreedosingBacilluscereusbacteriaagentshandlingtheexpe-rimentalgroup,twosetsofwatersamplesshakershakingcultureinthesameconditionsonadailybasisfortestingofwatersamplessuchaspH,ammoniaconcentrationandCODconce-ntrationindex,observedtwosetsofwatersamplesofpHchangesandammoniaconcentrati-onandCODconcentration.

SPSS17.0statisticalsoftware,dataonthedeterminationofsinglefactoranalysisofvari-anceresultsshowedthat:

therotationspeed150r/min,theliquidvolumeof100mLofdisso-lvedoxygensufficientday,twosetsoftestwatersamplespHvaluebasicallythesametrendandmagnitude,P>

0.05thereisnosignificantdifferencebetweenthetwogroups,sochang-esinthepHvalueofBacilluscereusplantfermentationwastewaterandnosignificantimpa-ct;

dailytwosetsoftestwatersamplesammoniaconcentrationtrenddeclineinthetreatmentgroupfellevenmoresharplybetweenthetwogroups,P<

0.05therewasasignificantdiffer-encefromthefirsttwodays,Bacilluscereusisthereductionofammoniaconcentrationintheplantfermentationwastewatereffectiveness;

dailytwotestwatersampleCODconcentr-ationfromthefirsttwodaysbetweenthetwogroups,P<

0.05,sotheBacilluscereusplantfermentationwastewaterCODconcentrationchangesalsohavesomebeneficialeffect.Ulti-matelycanbeconcludedthatBacilluscereusonamorepositiveandbeneficialroleinplantfermentationwastewaterpurification.

Keywords：

Ammonia;

Bacillus;

pHvalue;

chemicaloxygendemand

第一章文献综述

1.1引言

随着工业的高速发展和人口的膨胀，水环境污染问题越来越严重地威胁着人类的生存环境，制约着社会和经济的进一步发展[4]。

人类社会生产力的大幅提高和人口压力的不断增大，全球范围内的内陆水体富营养化现象日趋严重，我国2/3以上的湖泊和水库都处于富营养化的水平，使得富营养化成为我国湖泊目前和今后相当长一段时期内的重大水环境问题之一。

富营养化水体中，化学需氧量（COD）、生物耗氧量（BOD）、氨氮、硝酸盐与亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，水质恶化。

如果，能有效避免产生富营养化的有机物质及其分解产物的过量积累，就能获得良好的水质条件[10]。

因此，治理废水，保护世界上水资源免受污染已成为全球性课题[20]。

发酵废水属于高浓度有机废水，其处理是世界性难题，尤其在我国显得更突出。

我国是一个严重缺乏水资源的国家，人均占有量较低，而大量的工业废水、生活污水、农业回流水以及其他废弃物未经过处理就直接排入水体，造成水源的污染，引起水质恶化，使水资源显得更加紧张，给工业生产和人民生活带来了很大影响。

所以，节约用水已成为国家的技术政策[8]。

发酵工业，一直是我国工业的用水大户和污染大户。

如果实现发酵工艺过程中的水循环利用，就可以大量节省水资源，对促进生态环境和发酵工业的可持续发展具有重要的意义。

若要使废水既能达到国家制定的排放标准，又能满足发酵工厂循环利用的需求，就应在现行的发酵废水处理工艺的基础上进一步研究与改善，从而在保护环境和节约用水方面实现一个新的突破。

基于此，选育和培养高效安全的微生物菌剂，通过微生物直投法净水新技术可能改善和恢复养殖水体的生态环境，达到净水的目的[19]。

众多研究者已经通过试验证明芽孢杆菌菌株能迅速分解水体中的有机物，促进硫化物和亚硝酸盐的氧化，并且具有快速的生长繁殖能力和适应环境的能力。

G19蜡样芽孢杆菌菌株，是青岛根源生物研发中心研究开发的微生态制剂中的优势菌，能迅速分解水体中的有机物，有效降低水体中的氨氮含量，并且具有快速的生长繁殖能力和适应环境的能力。

梁晶晶等在青岛水产养殖池中使用该蜡样芽孢杆菌菌株后，养殖池中的有害物质氨氮等显著减少。

研究G19蜡样芽孢杆菌菌株对工业废水中有机物质的降解能力，将为工业生产废水的净化提供实践参考。

本研究，模拟好氧污水处理系统向废水水样中加入G19蜡样芽孢杆菌菌株探究其净水效果。

1.2废水处理的现状

废水处理的基本办法，有物理法、化学法和生物法。

废水物理处理法，包括格栅、沉淀池和沉沙池、气浮装置。

废水化学处理法，包括中和处理法、混凝处理法、化学沉淀法、氧化还原法、吸附法、离子交换法、膜分离法等。

废水生物处理法，包括活性污泥法、生物膜法、自然生物处理法、废水厌氧生物处理法、废水的脱磷除氮等[1]。

它们各有特点，可以相互配合使用,但其中以生物学的处理方法经济、方便、效果好，应用最广[2]。

在污水生物处理中微生物起着特别重要的作用，它利用微生物生命活动过程对废水中污染物进行转移和转化作用，使废水得到净化的处理方法[5]。

其主要特征是应用微生物在为充分发挥微生物的作用而专门设计的生化反应器中，将废水中的污染物转化为微生物细胞以及简单形式的无机物。

与物理化学方法相比，生物处理法具有一系列特点。

由于污染物的生化转化过程不需要高温、高压，在温和的条件下经过酶催化即可高效并相对彻底完成。

因此，处理费用低廉，微生物具有来源广，易培养、繁殖快，对环境适应性强和易实现变异等特性，适当地对其加以培养繁殖，特别是在一定特定条件下进行驯化，就能使之很好地适应各种有毒的工业废水环境。

通过有针对性地对菌种进行筛选、培养和驯化，可以使大多数的有机物质实现生物降解处理，由此可以对废水水质的使用面越来越宽。

废水生物处理法不加投药剂，可以避免对水质造成二次污染[6]。

另外，在污水处理过程中生物处理效果良好，不仅能将水体中的含碳有机污物分解成CO2、H2S、CH4等气体；

将含氮有机污物分解成NH3、HNO3、HNO2和N2；

将汞、砷等对人体有毒的重金属盐在水体中转化除去，使许多病原性寄生物常因环境不适而死去，还能去处臭味、提高透明度、降低色度等。

所有这些优点，都使生物处理法处理废水成为废水处理方法的首要选择。

因此，利用微生物的活动，清除水体中的污染物质是一条主要的环保途径。

利用生物进行环境保护和环境污染处理的方法中涉及的微生物很多，原核细胞型微生物中的细菌、放线菌、光合型原核生物等、还有真核细胞型微生物中的真菌（霉菌、酵母菌等）、藻类、原生动物等，还有一些非细胞型微生物（主要是病毒，不具备细胞结构，只是核酸与蛋白质组成的大分子，只含DNA或RNA一种类型核酸）。

有益微生物对水环境的微生物调控，水质的净化作用，越来越受到人们的重视。

以芽孢杆菌为主导菌的微生物复合菌，在改善水体环境质量和维持水生动物消化道微生境的生态平衡，提高养殖动物免疫能力，降低发病率，促进动物生长等方面的作用引起了水产学界的关注。

这类有益微生物具有促进水体中的有机污物的降解、能量转化、资源的再生利用以及高效、无污染、低成本的特点，在生态环境保护中发挥着重要的作用[14]。

1.3废水生物处理的发展趋势

从国内外废水生物处理的研究与应用现状和发展来看，各种新型的废水生物处理工艺不断推出，废水处理效率越来越高，未来废水处理将向着先进、高效、节能、自动化程度更高的方向发展，并在以下方面取得突出进展[3]。

固定化生物技术在处理难降解有机物、高COD和高色度废水以及除氮，处理含重金属废水方面具有良好的效果。

随着现代生物工程技术的不断发展，微生物在废水处理中的特殊作用不断得到挖潜，一些具有特异性的优势菌种不断得到改造或创造，将这些高效专性菌如脱色菌、脱氮、脱磷菌、假单胞菌等进行固定化后，菌体密度提高，大大提高了处理效率，尤其是对难降解有毒物质的治理有明显的优势。

近年来一直是水处理领域的研究热点，并已取得阶段性成果，尤其是在美国和日本已有不少具有一定规模成功应用的工业实例。

此技术，在处理生活污水和纺织、屠宰、造纸等废水及核污染中得到广泛的应用。

但是，固定化生物技术要达到工业化应用还需要解决一些问题，如:

如何准确测量细胞，微生物在固定化载体上的生长繁殖，如何降低固定化载体的成本及提高载体的使用寿命等，这些均需要进行深入细致的研究。

填料和载体是生物膜反应器的一个重要组成部分，其使用恰当与否直接关系到反应器的处理能力和运行效果。

如何进一步改善载体的质构，如:

改善其表面活性来提高对微生物的附着能力、加强传质，改善粒径与比表面积的关系以提供更大的孔隙率和比表面积，改善材质以降低生产成本及运行成本等，将成为这一领域中较为集中的研究课题。

同时，各种新型填料和载体产品的研究应用，如无机及生物陶粒、活性炭、混合填料等，在多类废水处理中已取得可喜的效果[3]。

目前，国外出现的投菌法处理污水已引起人们的重视，投菌法就是从土壤中培养、筛选出对特定污染物有较强降解功能的菌种，然后将其投入生化处理装置进行污染物处理以提高处理效率。

在进入80年代以来，欧、美、日等国在处理系统中投加高效菌种以提高处理效率，其菌种已成为商品使用。

随着生物技术的进步，各种高科技生物制品不断出现，也促进了废水处理技术的发展。

比如日本的有效菌（EM）技术，它在水质净化方面能够发挥神奇的作用。

目前，世界上已有50多个国家引进了EM技术，其中印尼、孟加拉国、不丹、尼泊尔已开始兴建EM粉工厂，印度准备用它来治理恒河的污染。

中国科学院土壤研究所在南京也成立了EM生物技术评估监测中心，将其纳人农业科研课题[4]。

1.4蜡状芽孢杆菌的形态特征及应用

蜡状芽孢杆菌细菌是芽孢杆菌属（Bacillus）中的一种，对外界有害因子抵抗力强，分布广。

菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×

3.0～5.0微米。

产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，孢囊无明显膨大。

革兰氏阳性，无荚膜，运动。

菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。

菌落形态：

在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落（似蜡烛样颜色）直径5-7mm。

在M.S.P培养基上生长更旺盛，菌落直径达8-10mm，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。

在蛋白胨酶母膏平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。

蜡状芽孢杆菌可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境。

还可以产生细菌蛋白酶，可用于麻脱胶，是各种抗生素抗菌活性的测定菌。

另外，可用于明胶液化，牛奶胨化，还原硝酸盐、水解淀粉。

1.5芽孢杆菌在废水处理中的应用

芽孢杆菌（Bacillus）是一类需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性细菌（G+），在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的革兰阳性、杆状细菌，对高温、高热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品均有很强的抗逆性，生长迅速，适应范围广。

芽孢杆菌，是常用微生态制剂之一。

它产生的胞外酶能把养殖体和底泥中的淀粉、蛋白质、脂肪等有机物分解，从而达到降低养殖水体富营养化和减少底泥生成的作用。

芽孢杆菌还能有效的降解水体中的氨氮、亚硝酸盐和硫化物。

研究表明，芽孢形式的枯草芽孢杆菌制剂能耐受各种恶劣的环境和抑制基质，活性稳定，已被广泛应用于较高浓度的畜牧业、养殖水体的净化中，对氨氮、亚硝酸氮和CODMn有良好的去除效果，且能降低致病菌数量。

益生芽孢杆菌制剂直接投入水体中后，芽孢萌发迅速，生长繁殖亦快，从而对水体能较快地发挥净化作用。

试验表明，当将活化的益生芽孢杆菌反复数次投入水体中后，便能保证有足够的益生芽孢杆菌持久地生存在水体中[11]。

在江苏某人工配制河蟹育苗海水中投放芽孢杆菌，发现氨氮降低了8.9%。

陈静等对不同养殖水体的混合水样投加芽孢杆菌，结果发现氨氮下降了84.6%，亚硝酸盐下降了29%。

王彦波等在养殖鲫鱼的水体中投加芽孢杆菌，发现4d后CODMn的降幅可达27.69%[17]。

由于芽孢杆菌具有上述优良的生物特性，并在高浓度废水的实际处理中表现出巨大的应用优势。

因此，可考虑在营养物浓度不足的条件下，通过确定适合的投菌浓度，使芽孢杆菌在营养物浓度较低的封闭废水中生长并发挥作用[17]。

第二章材料和方法

2.1试剂和仪器

2.1.1主要试剂

表2-1试验试剂

药品规格生产单位

碘化钾分析纯天津市北方天医化学试剂厂

硫酸银分析纯天津市迈斯科化工有限公司

碘化汞分析纯姜堰市环球试剂厂

氯化铵分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂

硫酸汞分析纯上海化学试剂采购供应站经销（元竹）

氢氧化钠分析纯莱阳经济技术开发区精细化工厂

重铬酸钾分析纯天津市瑞金特化学品有限公司

酒石酸钾钠分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司

邻苯二甲酸氢钾分析纯天津市光复科技发展有限公司

蛋白胨BR生物试剂天津市广成化学试剂有限公司

酵母浸粉BR生物试剂北京双旋微生物培养基制品厂

营养琼脂BR生物试剂北京陆桥技术有限责任公司

2.1.2试验仪器

表2-2试验仪器

仪器名称

型号

生产单位

pH计

pHS-3C

上海精密科学仪器有限公司

离心机

TGL-16B

上海安亭科学仪器厂

L-550

长沙湘仪离心机仪器有限公司

电子天平

BS124S

赛多利斯科学仪器有限公司

架盘天平

3924

北京大栅栏天平厂

COD测定仪

DR1010

美国哈希公司

COD快速消解仪

DRB200

可见分光光度计

722S

恒温振荡培养箱

TZ-2DH

河北霸州长城医用设备厂制造

电热鼓风干燥箱

101-AB

天津市泰斯特仪器有限公司

隔水式恒温培养箱

GSP-9160MBE

上海博迅实业有限公司医疗设备厂

数显气浴恒温振荡器

CHA-S

无锡华泽科技有限公司

双人单面净化工作台

SW-CJ-1C

苏州净化设备有限公司

立式压力蒸汽灭菌锅

YXQ-LS-75SII

2.2菌种和培养基

2.2.1菌种

试验过程中，所用的菌株为G19蜡样芽孢杆菌，该菌株由青岛根源生物技术有限公司平度分公司研发中心提供。

2.2.2培养基

种子培养基（LB培养基）：

1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0gNaCl，溶于100mL去离子水，用10NNaOH调至pH7.0，121℃灭菌20min，4℃保存备用。

2.3菌种扩大培养方法

G19蜡样芽孢杆菌扩大培养的方法：

将G19蜡样芽孢杆菌接种到种子培养基中，在37℃、200r/min的恒温摇床中培养12h，待长出大量菌体，用此菌体接入废水水样。

2.4试验方法

首先，在青岛根源生物技术有限公司平度分公司酶制剂生产的发酵废水处理系统的好氧罐顶部取试验水样。

然后，在充分混合均匀后等量分装到6个500mL的三角瓶中。

其中3个三角瓶中的水样不加入G19蜡样芽孢杆菌，作为空白对照组进行培养。

另外3个三角瓶中的水样，则在分装前通过计算按照107个/mL的菌浓度加入扩大培养后经离心分离得到的G19蜡样芽孢杆菌菌体，作为试验组进行培养。

最后，用纱布封口，置于振荡培养箱中进行培养。

通过摇瓶振荡，对培养的废水水样进行充氧，以模拟好氧处理系统单元的曝气充氧过程。

培养过程中的温度，则模拟废水处理系统的实际情况不进行控温，处在变化的室温环境当中。

当天取回的废水水样，振荡培养前进行各项监测指标的检测。

培养的废水水样，每24h取样进行一次水质检测。

检测指标，主要包括培养水样的pH值、氨氮浓度和化学需氧量（COD的浓度），以分析加入的G19蜡样芽孢杆菌对废水水质的净化效果。

另外，在多次试验尝试后，再对培养的废水水样中的可检测的好氧菌的数量进行检测，以分析加入的G19蜡样芽孢杆菌是否会对废水水样中的可检测的微生物的数量产生影响。

利用SPSS17.0统计软件进行测定结果的分析，以判断未加入G19蜡样芽孢杆菌的空白组废水水样和加入G19蜡样芽孢杆菌的试验组废水水样之间的水质是否会产生差异，最终得出G19蜡样芽孢杆菌是否会对该厂废水的净化产生明显的效果。

2.5检测方法

2.5.1pH值的测定方法

酸度计（pH计）法：

【原理】

以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极组成电池。

在25℃理想条件下，氢离子活度变化10倍，使电动势偏移59.16mv。

许多pH计上有温度补偿装置，以便校正温度差异，用于常规水样监测可准确和再现至0.1pH单位，较精密的仪器可准确到0.01pH。

为了提高测定的准确度，校准仪器时选用的标准缓冲溶液的pH值与水样的pH值接近。

【试剂】　

由于pH标准缓冲液是pH测定的基准，所以其配制方法及其pH值的确定均须符合规定。

《中国药典》2005年版附录“pH值测定法”项下，规定了五种不同pH值的标准缓冲液，用来对pH计进行校正（定位）。

它们分别是：

草酸盐标准缓冲液、苯二甲酸盐标准缓冲液、磷酸盐标准缓冲液、硼砂标准缓冲液及氢氧化钙标准缓冲液，在25℃时它们的pH值分别为1.68，4.01，6.86，9.18，12.45。

一般常用以下三种：

1、0.05mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液（25℃时pH值为4.01）；

2、0.025mo1/L磷酸二氢钾和0.025mo1/L磷酸氢二钠溶液（25℃时pH值为6.86）；

3、0.0lmol/L四硼酸钠0.01M溶液（25℃时pH值为9.18）。

【器材】

pH计或离子活度计，玻璃电极，甘汞电极或银—氯化银电极，磁力搅拌器，50mL烧杯

【操作方法】

将水样与标准溶液调到同一温度，记录测定温度，把仪器补偿旋钮调至该温度处。

选用与水样pH值相差不超过2个pH单位的标准溶液校准仪器。

从第一个标准溶液中取出两个电极，彻底冲洗，并用滤纸吸干。

再浸入第二个标准溶液中，其pH值约与前一个相差3个pH单位。

如测定值与第二个标准溶液pH值之差大于0.1pH值时，就要检查仪器、电极或标准溶液是否有问题。

当三者均