色谱实验知识点整理Word文档下载推荐.docx

色谱实验知识点整理Word文档下载推荐.docx

《色谱实验知识点整理Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《色谱实验知识点整理Word文档下载推荐.docx（22页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

50ppm以上

无机气体、有机化合物

氢火焰离子化检测器（FID）

氦、氮

数ppm以上

有机化合物

电子捕获检测器（ECD）

氮

数ppb以上

有机卤素等化合物

火焰热离子检测器（FTD）

氦、（氮）

氮、磷化合物

火焰光度检测器（FPD）

约0.1ppm

硫、磷化合物

氮磷检测器（N/P）

质谱检测器（MS）

1、浓度型检测器：

测量的是载气中通过检测器组分浓度瞬间的变化，检测信号值与组分的浓度成正比。

热导检测器；

2、质量型检测器：

测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比。

FID；

3、广普型检测器：

对所有物质有响应，热导检测器；

4、专属型检测器：

对特定物质有高灵敏响应，电子俘获检测器。

几种气体装在钢瓶中的颜色：

氮气-黑色；

氢气-绿色；

氧气-蓝色；

氨气-黄色（填空）

氢火焰离子化检测器（FID）原理

在外加电场作用下，氢气在空气中燃烧，形成微弱的离子流。

当载气带着有机物样品进入氢火焰时，有机物与O2进行化学电离反应，所产生的正离子被外加电场的负极收集，电子被正极捕获，形成微弱的电流信号，经放大器放大，由记录仪绘出色谱峰。

质谱检测器的工作原理

质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。

以电子轰击或其他的方式使被测物质离子化，形成各种质荷比（m/e）的离子，然后利用电磁学原理使离子按不同的质荷比分离并测量各种离子的强度，从而确定被测物质的分子量和结构。

有机质谱仪主要用于有机化合物的结构鉴定，它能提供化合物的分子量、元素组成以及官能团等结构信息。

分为四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪和磁质谱仪等。

本实验中使用的是四极杆质谱仪。

（填空题）

色谱柱选择

色谱柱的选择主要是选择固定液或固定相，遵循“相似相溶”原理。

基于此原理的色谱流出规律如下：

①分离非极性物质：

一般选用非极性固定液，这时样品中的各组分按沸点次序先后流出色谱柱，沸点低的先流出，沸点高的后流出；

②分离极性物质：

选用极性固定液，这时样品中的各组分主要按极性顺序分离，极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱；

③分离非极性和极性混合物：

一般选用极性固定液，这时非极性组分先出峰，极性组分（或易被极化的组分）后出峰。

挥发性有机酸属于极性物质，所以选择极性色谱柱DB-WAXetr，其固定相是聚乙二醇（PEG），强极性。

最高使用温度240℃。

苯系物是非极性的化合物，部分有弱极性，针对苯系物样品的测定，选择固定相为5%苯基95%二甲硅亚芳基硅氧烷的非极性柱DB-5MS，“MS”是指针对质谱检测器设计的低流失气相色谱柱。

三、气相色谱定性定量方法（掌握）

1、利用纯物质保留时间定性的方法

利用保留值定性：

通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。

不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

它的依据是在相同的色谱操作条件下，同一种物质应具有相同的保留值，当用已知物的保留时间与未知物组分的保留时间完全相同，则认为它们可能是相同的化合物。

这个方法是以各组分的色谱峰必须分离为单独峰为前提，同时还需要有作为对照用的标准物质。

利用加入法定性：

将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

2、质谱图定性方法

以相同的70eV能量电子轰击样品束，同一种物质应具有相同的质谱图。

国际上通用的标准质谱库收集了大部分已知化合物在70eV电子轰击电离源下产生的质谱图，如NIST库。

用未知物组分的质谱与质谱库中的标准图比对，按照相似度可排列出可能的化合物。

如果要进一步确认，则需用标准样品进样，以保留时间辅助确定。

3、色谱定量方法

色谱定量分析的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。

数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。

因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进行定量分析。

外标法又称标准曲线法，依照测量标准品所绘制的曲线来计量被测样品的含量的方法。

当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。

其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。

一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。

优点是不使用校正因子，准确性较高，适用于标准曲线的基体和样品的基体大致相同的情况下大批量试样的快速分析；

缺点是操作条件变化对结果准确性影响较大，当样品基体复杂时不正确，对进样量的准确性控制要求较高。

内标法是选择适当的物质作为内标物质，定量加入被测样品中，根据被测组分和内标物质的峰面积之比，乘以校正因子，对应内标物质加入量所进行含量测定的方法。

其优点是色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高；

缺点是选择合适的内标物质比较困难。

归一法即面积归一法，是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总面积峰的比值来定量的方法。

优点是简便易懂；

缺点是要求检测器对所进样品全部都能响应，而且相应的校正因子应尽量相近，只能进行粗略定量，不宜用于微量杂质的检查。

标准加入法是将一定量已知浓度的标准溶液加入待测样品中，测定加入前后样品的浓度。

加入标准溶液后的浓度将比加入前的高，其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量。

如果样品中存在干扰物质，则浓度的增加值将小于或大于理论值。

标准加入法可以有效克服外标法基体复杂时不准确的缺点，但速度很慢，适合样品数量少的时候用。

四、气相色谱预处理技术

1、将取得的污泥发酵液，离心5000-8000转/min，取上清液过0.45um膜，稀释50-100倍，在2mL气相色谱样品瓶中，加入0.9mL稀释后样品，再加入3%磷酸0.9mL（使得pH<

2）。

2、吹扫捕集

原理：

通过吹脱管用氮气将水样中的挥发性有机物VOCs连续吹脱出来，通过气流带入并吸附于捕集管中，待水样中VOCs被全部吹脱出来后，停止对水样的吹脱并迅速加热捕集管，将捕集管中的VOCs热脱附出来，进入气相色谱仪。

气相色谱仪采用在线冷柱头进样，使加热脱附的VOCs冷凝浓缩，然后快速加热进样。

与其他方法相比，吹扫捕集法具有样品用量少，组分损失小，检测限低，无溶剂污染，操作快捷方便等特点。

吹扫捕集条件：

吹脱时间8min，捕集温度35℃，解析温度180℃，解析时间6min，烘烤温度220℃，烘烤时间25min，吹扫气体为高纯N2，吹脱流速40mL/min。

（掌握）

五、气相色谱试验步骤

1.气相色谱（FID）测定污泥发酵液中的挥发性有机酸

1.通载气N2约1分钟后，打开氢气和空气钢瓶。

2.打开稳压电源、打开气相色谱仪主电源，打开电脑及工作站。

3.分别设定柱温、进样口温度和检测器温度50℃、220℃和250℃。

4.当温度达到设定值后，在工作站中，设定分析文件名、文件路径和仪器方法，等待仪器显示ready。

6.将标准样品系列依次从低浓度到高浓度手动进样0.5uL，按start按钮开始进样测试。

7.将样品自动进样0.5uL，按start按钮开始进样测试。

8.测试结束后，对每个色谱图进行积分处理，并记录所有数据。

9.启动降温程序，待柱温、进样口温度和检测器温度均降至50℃以下后，依次关闭气10.相色谱仪、化学工作站，关掉气体钢瓶及稳压电源。

2、吹扫捕集-气相色谱-质谱联用法测定污水中苯系物

1．在工作站中，设定分析文件名、文件路径和仪器方法，等待仪器显示ready。

2．将标准样品系列依次从放在吹扫捕集自动进样器的样品盘上，点start按钮开始，吹扫捕集装置将按照设定好的程序进行吹扫、捕集，脱附后样品直接注入气相色谱，自动开始色谱测定。

3．测试结束后，对每张色谱图的每个色谱峰进行定性分析，通过搜索标准质谱库，为每个色谱峰定性，并进行积分处理，并记录所有数据。

六、气相色谱注意事项

1、检测器温度不能低于进样口温度，否则会污染检测器进样口温度应高于柱温的最高值，同时化合物在此温度下不分解。

2、含酸、碱、盐、水、金属离子的化合物不能分析，要经过处理方可进行。

3、进样器所取样品要避免带有气泡以保证进样重现性。

4、取样前用溶剂反复洗针，再用要分析的样品至少洗2-5次以避免样品间的相互干拢。

5、需直接进样品，要将注射器洗净后，将针筒抽干避免外来杂质的干拢。

七、气相色谱思考题

1.影响气相色谱分离的因素有哪些？

对于不同的分析对象，只要选择合适的流动相和固定相，一般可以达到分离的目的。

这也是色谱分离比其他分析法具有更高的分离能力和选择性的原因。

但当分析不同类型样品时，需要换用不同的色谱柱才能实现相应的分析要求。

同时，色谱三温（汽化室温、柱温和检测室温度）的优化也是十分重要的影响因素。

2.通过标准谱库的检索，分析出峰时间为5.59min、7.17min和7.79min的色谱峰代表什么物质？

氯苯正丙苯异丁苯

3.通过S/N分析质谱分析中，全扫描和单离子扫描的区别。

全扫描是对指定质量范围内的离子全部扫描并记录，得到的是完整的制品图，它提供未知物的相对分子质量和结构信息，可以进行库检索，灵敏度较差。

选择离子扫描是对离子进行选择性检测，只记录选定的离子，不相关的干扰离子统统被排除；

选定离子的检测灵敏度大大提高。

但选择离子扫描值能检测有限的几个离子，不能得到完整的质谱图，因此不能用来对未知物进行定性分析。

4.吹扫捕集预处理与顶空预处理的特点和区别。

顶空色谱进样法是一种方便、快捷的色谱进样技术。

其基本原理就是将待分析的样品置入一密闭容器内，在一定温度下样品中的挥发性组份经过一段时间，在两相中达到平衡，通过抽取顶部空间气体进行色谱分析。

吹扫捕集通过吹脱管用惰性气体将水样中的挥发性有机物VOCs连续吹脱出来，通过气流带入并吸附于捕集管中，待水样中VOCs被全部吹脱出来后，停止对水样的吹脱并迅速加热捕集管，将捕集管中的VOCs热脱附出来，进入气相色谱仪。

与其他方法相比，吹扫捕集法克服了色谱分离中溶剂主峰掩盖其他峰的问题，而且比静态顶空有更高的检测灵敏度，有富集功能，更适于痕量和超痕量分析，具有样品用量少，组分损失小，检测限低，无溶剂污染，操作快捷方便等特点。

存在的问题是，所用时间较多，吹扫中有可能引入杂质以及吸附剂性能的选择等。

两者区别：

（1）目前的顶空主要是做易挥发性的物质，而吹扫捕集的加热温度能达到检测半挥发性物质的要求；

（2）吹扫捕集相对顶空来说，灵敏度会更高，但是吹扫中有可能引入杂质，特别是容易造成样品之间的交叉污染，从而它的重现性也会受到牵连。

而顶空却能杜绝吹扫的弊端；

（3）吹扫捕集的的U型管道是不能经受得信酸碱的腐蚀的，比如说水中三氯乙醛的检测，加入固体氢氧化钠后，总有一天会让管道堵住或者是被腐蚀。

而压力模式进样的顶空进样器却不会受到任何影响。

也就是说，从灵敏度方面来说，吹扫捕集是优于顶空的；

而从重现性来说，压力进样方式的顶空必定高于吹扫捕集，特别是那种带有吹扫功能的动态顶空，灵敏度还可以与吹扫捕集媲美。

5.在气相色谱分析中为了测定下面组分，宜选用哪种检测器？

为什么？

（1）蔬菜中含氯农药残留量；

电子捕获检测器electroncapturedetector,ECD高选择性检测器，仅对含有卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限10-14g/mL，对大多数烃类没有响应。

较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。

（2）痕量苯和二甲苯的异构体；

质谱检测器？

FID检测器

（3）啤酒中微量硫化物。

火焰光度检测器（FPD）火焰光度检测器是一种高灵敏度，仅对含硫、磷的有机物产生响应的高选择性检测器，适用于分析含硫、磷的农药及环境样品中含硫、磷的有机污染物。

第二章液相色谱

一、液相色谱的基本原理

液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。

分配色谱原理：

主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。

Agilent1200LC液相色谱仪的工作过程：

输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。

正相色谱法　采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；

流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。

常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；

流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。

适用于分离非极性和极性较弱的化合物。

RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法

反相色谱法

固定相极性

高～中

中～低

流动相极性

低～中

中～高

组分洗脱次序

极性小先洗出

极性大先洗出

二、液相色谱仪的组成结构及作用

1、输液系统：

恒流泵和恒压泵，单元泵和多元比例泵等梯度洗脱

进样器、六通阀等；

3、分离系统：

色谱柱和梯度洗脱控制装置；

检测器、信号放大器装置等；

5、数据处理系统：

记录仪或数据采集、数据处理软硬件。

Agilent1200LC液相色谱仪

（四元泵、自动进样器、柱温箱、UV-VIS检测器、C18色谱柱），稳压电源。

流动相——真空在线脱气机——四元比例阀——主动输入阀——泵头——出口单向阀——压力阻尼器（侧压力）——泵头——排液阀——自动进样器（其冷凝水排水管必须高于收集瓶，不能浸在液体里。

其下有一控温模块，定量环标配100ul，一般进样量5ul-50ul较好）——柱温箱——紫外监测器（流通池）——荧光检测器（一定要荧光串联在紫外之前，因其流通池耐压20bar，紫外可耐压40bar）

C18柱-反相HPLC（reversedphaseHPLC）

由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。

其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。

是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。

紫外-可见光（UV-VIS）检测器原理

基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。

很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。

由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。

用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。

（Agilent1200UV-VIS检测波长范围为190nm-600nm）

Lambert-Beer定律：

当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.A=lg（1/T）=Kbc（掌握）

A为吸光度,T为透射比,是透射光强度比上入射光强度c为吸光物质的浓度b为吸收层厚度。

二极管阵列检测器（diode-arraydetector,DAD）工作原理

以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。

与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。

而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。

（Agilent1200DAD全扫描波长范围为190nm-950nm）。

三、液相色谱定性定量方法

根据标准样品的保留时间定性；

根据标准样品的的标准曲线定量（外标法）

标准曲线绘制方法：

（1）先打开数据file-loadsignal,选中一个数据文件-ok

（2）Calibration-Newcalibration-定一个浓度值-ok（3）在compound里输入峰名（4）多点校正，重复

（1）后，在校正中添加级别，（3）完成后，保存方法

四、液相色谱试验步骤

（1）准备

根据待测物要求配制多个浓度点标准样品，待测样品（样品需要前处理），准备HPLC所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。

（2）样品分析

1）开机。

打开电脑、HPLC各组件电源（所有组件）、打开软件。

2）配置仪器，打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡。

（逆时针方向旋松泵头（2-3圈）——在软件上泵模块，设置泵里控制排A（设为100%）或B，流速为3-5ml/min，排5-10min，A相排完后，直接切换到B，即将B相设为100%，确认即可——依次排所需流动相——各流动相均排完后将流速改回原来的1ml/min——顺时针方向旋紧泵头。

注意：

排气时注意观察压力，如果压力超过10bar，报警，可能是滤芯脏了）

3）建立平衡柱子分析方法，保存并运行。

4）在脱机状态下建立样品分析方法，设置自动进样器方法（sequence），设置数据保存文件。

5）待柱子平衡后，运行所设置的sequence，分析标准样品及实际样品。

6）建立清洗及保存柱子的方法，并在样品分析结束后运行。

7）所有程序结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭主机、电脑及相关附件。

（3）数据处理

可在脱机状态下整理实验数据。

五、液相色谱思考题

1、为什么溶剂和样品要过滤?

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。

色谱柱：

由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

仪器：

溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

2、流动相使用前为什么要脱气？

脱气的方法？

（简答）

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。

气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。

溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

若用FLD，可能会造成荧光猝灭。

脱气方法：

逆时针方向旋松启动阀和废液阀，在软件上，泵流速设置为1-3mL/min并开泵，在废液阀处用注射器接出废液，1-2min后，关闭废液阀，再冲洗1~2分钟后，停泵，旋紧启动阀，流速设回1mL/min。

（注意：

不要过度拧紧废液阀和启动阀！

）

3、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？

溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4-7）。

以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。

A：

请严格执行溶剂过滤。

B：

请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液

C：

如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.

D：

在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。

E：

避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。

溶剂瓶里的砂心滤头清洗方法：

用浓硝酸（分析纯）泡1小时左右，再用液相用水泡1-2小时，冲洗干净即可，不建议用超声洗。

4、系统压力过高的原因有哪些？

压力过高，可能的原因：

A色谱柱进口过滤芯被污染

B冲洗阀过滤芯被污染

C色谱柱被污染

D连接管路的毛细管赌赛

E进样器转子上的凹槽被赌赛

F进样针或针座被赌赛

5、新柱子活化：

（一般情况）

1）90%水，10%甲醇冲洗10-20min，2）90%甲醇，10%水稳定30min，具体根据各柱子的说明书来做，有的柱子是直接用100%的有机溶剂来活化。

6、清洗及保存柱子的方法：

1）95%水，5%甲醇，1ml/min，冲洗半小时；

2）再过度到100%甲醇（半小时作用）；

3）用100%甲醇冲洗1小时。

（短期内使用），如果长期不用，建议90%的甲醇，10%的水保存，因为有机相易挥发，长期不用，柱子会干。

如果加盐的话（峰形更漂亮），要用脱盐系统，并且清洗时，要将盐相换成水相，不能用盐洗系统。

7、4个溶剂瓶里的砂心滤头清洗方法

换溶剂、过滤头后，都要排气泡。

如果系统进气泡：

用异丙醇，低流速赶气泡

8、紫外-可见光检测器等度分析苯类化合物：

实验目的、实验原理、优缺点、适用范围、实验步骤（包括前处理，实验基本操作，实验结果分析，后续处理仪器保养）？

（试验设计题）

选择流动相时应该注意几个问题：

1）尽量使用高纯度试剂做流动相，防治微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加；

2）避免流动相和固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子；

3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积；

4）流动相同时还应满足检测器的要求，流动相不应有紫外吸收；

6、高效液相色谱定性、定量的依据是什么？

7、高效液相色谱分析的特点及应用范围

1）高压：

流动相为液体，流经色谱柱时，收到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加压；