农药虫螨腈含量的测定HPLC法文档格式.docx
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为了满足政府管理、加工企业质量控制和检验检疫行政执法的需求,我们开展了《婴儿奶嘴中亚硝胺迁移量的测定方法》标准的起草工作。
二、编制依据
1.本标准方法根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分:
标准的结构和编写》和SN/T1831-2006《进出口化矿金商品化学分析方法标准编写的基本规定》的要求编写制订。
2.本标准参考有关文献,经研究、改进和验证后制定。
三、方法概述
将试样用人工唾液浸泡,N-亚硝胺迁移到浸泡液中,经固相萃取柱,气相色谱-正化学源质谱(GC-PCI/MS)测定,外标法定量。
四、实验论证
1.样品前处理条件优化
1.1样品测定状态及提取液的选择
在国内外相关文献中,对于迁移量的测定的样品状态有两种:
一种是将样品剪切成一定形状和面积的待测试样,另一种是保持样品完成性;
对于待测组分的提取方式基本有两类:
一类是用有机溶剂(如:
甲醇)浸泡提取,另一种是采用模拟体液浸泡提取。
为更贴近奶嘴的使用过程并确保方法的稳定性,在本标准的测定过程中,将奶嘴纵向剖开浸泡。
同时为了更加真实的模拟亚硝胺的迁移过程并参考国内外相关文献及标准,所采用的浸泡溶液为人工唾液,其配置过程为将4.2g碳酸氢钠,0.5g氯化钠,0.2g碳酸钾和30mg亚硝酸钠溶于水中并稀释至900mL,用0.1mol/L盐酸或0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值到9.0,定容到1L,有效期2周。
1.2提取过程中浸泡溶液的体积及浸泡时间
参考国内外相关标准和文献,结合本标准测定实际,确定浸泡溶液的体积为40mL,浸泡时间为(24±
0.5)h。
最终分别用4mL人工唾液洗涤试样两次,合并洗涤液,加入1mL的1mol/L氢氧化钠溶液,摇匀。
1.3提取液中待测组分萃取过程的确定
参考国内外相关标准和文献,提取液中待测组分的提取主要有两种途径:
一种是用液-液萃取法,即选择疏水性溶剂(如二氯甲烷)为萃取剂,利用被测组分在水与溶剂之间的溶解度差进行萃取;
一种是将提取液经过固相萃取柱浓缩净化。
为比较萃取效果,进行如下实验:
取一个150mL具塞棕色梨形瓶,加入1.0mL的1.0mol/L12种亚硝胺混标溶液和48mL人工唾液,充分摇匀。
再加入1.0mL的1mol/L氢氧化钠溶液,混匀。
方法一(液液萃取):
向其中加入20mL二氯甲烷,振荡萃取2min,静置分层。
收集下层有机相,使其通过经25mL二氯甲烷洗涤过的30g无水硫酸钠,用150mL具塞棕色梨形瓶收集。
重复上述萃取过程三遍,合并有机相。
方法二(固相萃取):
用6mL二氯甲烷、6mL甲醇和10mL水依次通过活性炭固相萃取柱(500mg/柱,6mL)。
将溶解了N-亚硝胺混标的人工唾液以小于5mL/min的流速经过活化好的固相萃取柱,真空抽干30min。
将固相萃取柱下端串联经4mL二氯甲烷活化的装了2.5g无水硫酸钠的干燥柱,用10mL二氯甲烷洗脱,流速小于1mL/min,收集洗脱液于50mL棕色具塞梨形瓶中。
将经过方法一、方法二得到的洗脱液于30℃水浴中旋转蒸发至少于5mL,用氮气温和吹至近干,用二氯甲烷溶解并定容至1.0mL。
分别上仪器检测,两种方法的回收率实验结果见图2。
1:
N-亚硝基二甲基胺、2:
N-亚硝基甲基乙基胺、3:
N-亚硝基二乙基胺、4:
N-亚硝基二丙基胺、5:
N-亚硝基二丁基胺、6:
N-亚硝基-N-甲基苯胺、7:
N-亚硝基-N-乙基苯胺、8:
N-亚硝基哌啶、9:
N-亚硝基吡咯烷、10:
N-亚硝基吗啉、11:
N-亚硝基二苯基胺、12:
N-亚硝基二苄胺
图2:
12种N-亚硝胺两种萃取过程回收率的比较
通过比较可见,经过两种方法萃取的12种N-亚硝胺的回收率都在可接受范围。
但液液萃取的方法处理过程繁琐,耗费试剂量大,占用大面积试验台,不利于批量样品的快速处理。
固相萃取的方法大幅简化了样品前处理流程,节约了时间和人力,减少了有机溶剂用量,降低了对环境的污染,所以在本标准中采用固相萃取的处理方式。
1.4固相萃取柱的选择
本标准考察了文献提到的用于水介质中N-亚硝胺萃取的碳18柱、活性炭柱对12种N-亚硝胺的萃取效果。
碳18柱(500mg,3mL):
用6mL二氯甲烷、6mL甲醇和10ml水依次通过碳18柱。
将溶解了1mL的1.0μg/mL亚硝胺混标的人工唾液以小于5mL/min的流速经过活化好的固相萃取柱。
上样后,真空抽干30min。
将固相萃取柱下端串联经4mL二氯甲烷活化的盛有2.5g无水硫酸钠的干燥柱,用10mL二氯甲烷洗脱,流速小于1mL/min,收集洗脱液于50mL具塞棕色梨形瓶中。
活性炭柱(500mg,3mL):
步骤同于碳18柱。
将上述经过洗脱液的梨形瓶在30℃的水浴中缓慢浓缩至少于5mL,用氮气温和吹至近干,用1.0mL二氯甲烷淋洗瓶壁并收集到试样瓶中,用二氯甲烷定容至1mL。
分别上仪器测定,两种方法的回收率实验结果见图3。
1:
图3:
12种N-亚硝胺萃取两种固相萃取柱回收率的比较
从图3可见,综合考虑12种N-亚硝胺的情况,活性炭萃取柱的效果最佳。
1.5洗脱剂用量的确定
将溶解了1mL的1.0μg/mL亚硝胺混标的人工唾液以小于5mL/min的流速经过活化好的活性炭固相萃取柱,真空抽干30min,下端串联经4mL二氯甲烷活化后的盛有2.5g无水硫酸钠的干燥,用10mL二氯甲烷分别分5次洗脱,每次用量2mL,将前3次的洗脱液收集于一个50mL具塞棕色梨形瓶中、第4次的洗脱液收集于一个50mL具塞棕色梨形瓶中、第5次的洗脱液收集于一个50mL具塞棕色梨形瓶中洗脱液于50mL具塞棕色梨形瓶中。
浓缩后上样测定并计算累积回收率,结果见图4。
图4:
12种N-亚硝胺萃取四种固相萃取柱回收率的比较
通过图4可见,洗脱剂用量为6mL时,N-亚硝基-N-甲基苯胺、N-亚硝基-N-乙基苯胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二苯基胺的回收率较洗脱剂用量为10mL时的回收率偏低,说明6mL洗脱剂的用量不够;
洗脱剂用量为8mL和10mL相比,12种亚硝胺的回收率变化不大,说明这时的洗脱剂用量是合适的。
所以本标准采用10mL二氯甲烷洗脱的方案。
1.6浓缩洗脱液条件的确定
文献中对浓缩洗脱液时不同的水浴温度和旋转蒸发的转速进行了比较,发现40℃时回收率最高。
由于本研究中洗脱液量只有10mL,用40℃旋转蒸发速度过快,浓缩液迅速蒸干,随后用二氯乙烷溶解时会出现絮状不溶物,导致测定结果偏低且不稳定。
结合本标准的实际情况,本标准选择30℃,且浓缩至少于5mL,用氮气温和吹至近干,用二氯甲烷溶解并定容至1.0mL,通过实验发现其回收效果满意。
2.仪器条件优化
2.1色谱柱的选择:
文献比较了非极性柱DB-5MS、中等极性柱DB-35MS和极性柱DB-624对目标分析物的分离效果:
N-亚硝胺的强极性导致其在非极性柱DB-5MS和中等极性住DB-35MS上的分离效果不理想,而在极性柱DB-624上得到了很好的分离。
DB-WAX极性与DB-624相似,通过实验发现12种N-亚硝胺在DB-WAX上有较好的分离(见图5和图6)。
色谱柱DB-WAX是目前大多数气相色谱仪配置的通用柱,经过优化条件,可以达到预期效果。
作为通用柱,可以在实验室间的协作实验时比较容易获得,使得该方法在各基层实验室易推广应用。
2.2离子源的选择:
N-亚硝胺分子量较小,通过实验发现,用气相色谱-电子轰击源质谱法(GC-EI/MS)进行分析时,特征碎片离子不明显、背景干扰较大,尤其是测定样品时严重的干扰使得目标分析物几乎完全无法找到,图7为用EI源测定10种10μg/L的N-亚硝胺时的总离子流图,图8为用EI源测定12种10μg/L的N-亚硝胺时的选择离子扫描图。
化学源是一种软电离源,由于N-亚硝胺具有碱性和亲核性,以甲烷气为反应气的正化学源不仅灵敏度高(尤其是较高沸点的半挥发性有机化合物),而且选择性强,受到柱流失和基体成分影响相对较少从而干扰少,分子离子峰和相应的加合离子峰强度高,分析结果更加可靠。
图为10μg/L的总离子流图,图为样品测定时的选择离子扫描图。
图5:
DB-WAX色谱柱正化学源测定12种N-亚硝胺(10μg/L)的总离子流图
图6:
DB-WAX色谱柱正化学源测定12种N-亚硝胺(10μg/L)的选择离子扫描图
N-亚硝基二乙基胺、2:
N-亚硝基二丙基胺、3:
N-亚硝基二丁基胺、4:
N-亚硝基-N-甲基苯胺、5:
N-亚硝基-N-乙基苯胺、6:
N-亚硝基哌啶、7:
N-亚硝基吡咯烷、8:
N-亚硝基吗啉、9:
N-亚硝基二苯基胺、10:
图7:
电子轰击源测定10种N-亚硝胺(10μg/L)的总离子流图
图8:
电子轰击源测定12种N-亚硝胺(10μg/L)的选择离子扫描图
通过图6~图8的比较可见,与EI源相比,CI源具有背景干扰少、响应度高的特点,从而提高了检测的准确性和有效性。
本研究采用正化学源(PCI),反应气为甲烷。
2.3程序升温的确定:
本方法升温程序是结合12种N-亚硝胺的物理和化学性质进行优化的,原则是在确保所有目标化合物能完全分离的基础上,兼顾在较短的时间内分析完样品。
因为N-甲苯基亚硝胺、N-乙苯基亚硝胺在DB-WAX柱上的保留时间很接近,而N-二苯基亚硝胺与N-二苄胺出峰时间较晚,所以升温程序优化过程中主要是改善N-甲苯基亚硝胺与N-乙苯基亚硝胺的分离,以及将N-二苯基亚硝胺与N-二苄胺出峰时间提前,在确保分离效果前提下缩短检测周期。
反复调整升温程序,最终确定:
60℃保持1min,以8℃/min升温至140℃保持5min,以50℃/min升温至240℃保持10min。
从图6可以看出,该升温过程较好的实现了各个目标分析物的有效分离。
2.4定量离子和定性离子的确定:
对12种N-亚硝胺的标准溶液进行全扫描,确定每种N-亚硝胺的特征离子和定量离子,见表1。
表1:
12种N-亚硝胺的保留时间、定量离子和定性离子
序号
名称
缩写
保留时间
min
定量离子
定性离子
1
N-亚硝基二甲胺
NDMA
6.831
75
74,76
2
N-亚硝基甲基乙基胺
NEMA
7.577
89
129,58,90
3
N-亚硝基二乙基胺
NDEA
8.062
103
72.1,102,131
4
N-亚硝基二丙基胺
NDPA
10.238
131
159.1,171.1,100.1
5
N-亚硝基二丁基胺
NDBA
13.460
159
128.1,187.1,199.1
6
N-亚硝基-N-甲基苯胺
NMPHA
13.601
108
107,136.1,106
7
N-亚硝基-N-乙基苯胺
NEPHA
13.692
122.1
121,150.1,123
8
N-亚硝基哌啶
NPIP
13.974
115.1
84.1,143.1,114
9
N-亚硝基吡咯烷
NPYR
14.795
101.1
70.1,100,102
10
N-亚硝基吗啉
NMOR
16.265
117
86,88,87
11
N-亚硝基二苯基胺
NDPHA
21.569
170.1
169,171,198
12
NDBzA
26.119
105
93,92,196.1
2.4载气流速的确定:
在不改变其它条件的前提下,通过改变载气流速来改善分离效果。
调整载气流速,使之分别为1.0mL/min、1.1mL/min,。
实验结果显示,流速为1.1mL/min时,虽然能够缩短分析周期,但N-亚硝基-N-甲基苯胺与N-亚硝基-N-乙基苯胺的峰重叠为一个峰,无法有效分离,见图9;
流速为1.0mL/min时,这两个峰恰好能有效分离。
所以确定载气流速为1.0mL/min。
图9:
载气流速为1.1mL/min时12种N-亚硝胺选择离子扫描图
2.5接口温度的确定:
在不改变其它条件的前提下,通过改变接口温度来改善分离效果。
色谱柱DB-WAX可使用的温度范围最高为260℃,所以调整接口温度,使之分别为240℃、260℃。
实验结果显示,接口温度对各目标物分离效果影响不大,所以确定接口温度为240℃。
2.6进样口温度的确定:
在不改变其它条件的前提下,通过改变进样口温度来改善分离效果。
调节进样口温度,使之分别为200℃、220℃、260℃。
实验结果显示,进样口温度为260℃时,各目标物都能完全分开,峰型较好,所以确定进样口温度为260℃。
3.最佳试验条件:
通过上述试验,确定的条件如下:
3.1试样处理
取至少40g有代表性的试样,放入装有沸水的150mL烧杯中(水尽量少,能浸没试样即可)保持沸腾10min。
用不锈钢镊子将试样取出,冷却至室温,剖开晾干,备用。
3.2提取
称取约10g(精确至0.0001g)处理好的试样于150mL棕色具塞锥形瓶中,加入40mL人工唾液,使试样全部浸没,盖好瓶塞。
将锥形瓶放入(40±
2)℃的恒温水浴振荡器中振荡提取(24±
将锥形瓶中溶液倒入100mL棕色具塞梨形瓶中,分别用4.mL人工唾液洗涤两次,合并洗涤液,加入1.0mL氢氧化钠溶液(4.11),摇匀,待净化。
3.3净化
用6mL二氯甲烷、6mL甲醇和10mL水依次通过活性炭固相萃取柱。
按照6.2.2的提取液以小于5mL/min的流速经过活化好的固相萃取柱,真空抽干30min。
将固相萃取柱下端串联经4mL二氯甲烷活化的干燥柱,用10mL二氯甲烷洗脱,流速小于1mL/min,收集洗脱液于50mL棕色具塞梨形瓶中,于30℃水浴中旋转蒸发至少于5mL,用氮气温和吹至近干,用二氯甲烷溶解并定容至1.0mL,待测。
3.4气相色谱-质谱仪条件
a)色谱柱:
DB-Wax,30m×
0.25mm×
0.25μm,或相当者;
b)色谱柱温度(程序升温):
初始柱温60℃,保持1min,以8℃/min升至140℃保持5min,以50℃/min升至240℃保持10min;
c)进样口温度:
260℃;
d)接口温度:
240℃;
e)载气:
氦气(纯度≥99.999%),流量1.0mL/min;
f)进样量:
1µ
L;
g)进样方式:
恒流,不分流进样;
h)电离方式:
正化学电离源(PCI);
i)电离能量:
70eV;
j)检测方式:
选择离子监测(SIM),监测离子及其保留时间见表1;
k)溶剂延迟:
3.5min。
4.方法验证:
1)线性试验:
分别配制浓度为1.0µ
g/L、5.0µ
g/L、10µ
g/L、100µ
g/L和1000µ
g/L的12种N-亚硝胺的混合标准溶液,在上述所建方法的条件下测定,所得峰面积数据及标准曲线的线性方程和线性相关系数见表2,标准曲线图见图10~图21。
表2:
线性试验结果
各浓度对应的峰面积
线性方程
相关系数
1.0µ
g/L
5.0µ
µ
100
µ
500
1000
13524
75336
153700
1540010
7570289
15410280
y=15374x-13560
0.9999
11019
56488
111480
1121365
5700311
11953672
y=11895x-44779
0.9997
12341
70784
152004
1518798
7131889
15213843
y=15084x-46070
0.9995
12856
65879
143884
1436371
6573796
14417937
y=14244x-61270
0.9991
3815
19020
41917
399573
1898735
4215730
y=4162.6x-24670
0.9988
5785
26977
49448
561892
2431469
5318924
y=5249.9x-14894
0.9990
7087
36001
63925
683775
3793465
7279587
y=7334.6x-1852.3
8429
40284
80341
827913
3983976
8198928
y=8165.7x-9305.4
7742
32942
84425
838063
3573291
8217989
y=8066.9x-46945
0.9979
6023
41134
87083
841572
4082543
8531615
y=8483.5x-1989.3
0.9998
18963
75531
152428
1564305
7735232
15813961
y=15771x-21013
5391
22206
50312
557529
2612892
5318657
y=5302.7x-359.9
图10:
N-二甲基亚硝胺标准曲线图11:
N-亚硝基甲基乙基胺标准曲线
图12:
N-亚硝基二乙基胺标准曲线图13:
N-亚硝基二丙基胺标准曲线
图14:
N-亚硝基二丁基胺标准曲线图15:
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- 农药 虫螨腈 含量 测定 HPLC