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任课教师姓名马志卿
考试日期2014.01
考试成绩
评卷教师签字处
噬菌体展示技术及其在农药残留检测上的应用
王东方
(西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100)
摘要:
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达,同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
到目前为止,人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。
本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等,并重点阐述一下噬菌体展示技术制备scFv重组抗体用于农药免疫残留分析上的应用,并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。
关键词:
噬菌体展示;
外源基因;
融和蛋白;
scFv;
重组抗体;
免疫残留分析
Phagedisplaytechnologyanditsapplicationinthedetectionofpesticideresidues
DFWANG
(CollegeofPlantProtection,NorthwestA&Funiversity,Yangling712100,ShanxiProvince,china)
Abstract:
PhagedisplaytechnologyistheDNAofanexogenousproteinorpolypeptidewhichisinsertedintotheappropriatepositionofthephagecoatproteinstructuralgene,theexogenousproteinwiththecoatproteinisexpressionsimultaneously,whiletheexogenousproteinwilldisplayinthesurfaceofphagecoatprotein.Sofar,therehasbeendevelopedasingle-strandedfilamentousphagedisplaysystem,λphagedisplaysystems,T4phagedisplaysystemsandsoon.Thispaperoutlinesisthebasicprinciplesofphagedisplaytechnology,phagedisplaysystemfeaturesAndfocusesonwhatphagedisplaytechnologytopreparefortheapplicationofrecombinantantibodiesscFvpesticideresidueanalysisonimmunization.
Keywords:
Phagedisplay;
exogenousgene;
fusionprotein;
scFv;
recombinantantibody;
immuneresidueanalysis
1985年,SmithGP[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,从而创建了噬菌体展示技术。
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,即在噬菌体表面展示特定蛋白质,而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。
另外,这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来,可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。
近年来,随着噬菌体展示技术的日益完善,该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。
1噬菌体展示技术的原理
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下,使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达,融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性,以利于靶分子的识别和结合。
肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集[2]。
所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
2噬菌体展示系统
2.1单链丝状噬菌体展示系统
2.1.1PⅢ展示系统,丝状噬菌体是单链DNA病毒,PⅢ是病毒的次要外壳蛋白,位于病毒颗粒的尾端,是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。
每个病毒颗粒都有3个~5个拷贝PⅢ蛋白[3],其在结构上可分为N1、N2和CT3个功能区域[4-5],这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。
其中,N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关[6],而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分,并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端[7]。
PⅢ有2个位点可供外源序列插入,当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时,该系统保留了完整的PⅢ蛋白,噬菌体仍有感染性;
但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连,则噬菌体丧失感染性,这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。
PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解,所以有辅助噬菌体超感染时,可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白,即所谓“单价”噬菌体。
2.1.2PⅧ及其他展示系统,PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白,位于噬菌体外侧,C端与DNA结合,N端伸出噬菌体外,每个病毒颗粒有2700个左右PⅧ拷贝[8-9]。
PⅧ的N端附近可融合五肽,但不能融合更长的肽链,因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配[2,10-11],使其失去感染力。
但有辅助噬菌体参与时,可提供野生型PⅧ蛋白,降低价数,此时可融合多肽甚至抗体片段。
此外,尚有丝状噬菌体PⅥ展示系统的研究报道[12]。
PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表面,可以作为外源蛋白的融合位点,可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能。
从所掌握的文献来看,该系统主要用于cDNA表面展示文库的构建,并取得了不错的筛选效果。
2.2λ噬菌体展示系统
2.2.1PV展示系统,λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分,该管状结构由32个盘状结构组成,每个盘又由6个PV亚基组成。
PV有两个折叠区域,C端的折叠结构域(非功能区)可供外源序列插入或替换。
目前,用PV系统已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶(465ku)和植物外源凝血素BPA(120ku)等[13]。
λ噬菌体的装配在细胞内进行,故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。
该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体,这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。
2.2.2D蛋白展示系统,D蛋白的分子质量为11ku,参与野生型λ噬菌体头部的装配。
低温电镜分析表明,D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面[14]。
当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,故D蛋白可作为外源序列融合的载体,而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。
病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外,体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面,而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中,从而补偿溶源菌所缺的D蛋白,通过热诱导而组装。
该系统有一个很好的特点,噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制,这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
2.3T4噬菌体展示系统
T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。
它的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质,分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC(9ku)和HOC(40ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面,因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化,避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。
T4噬菌体是在宿主细胞内装配,不需通过分泌途径,因而可展示各种大小的多肽或蛋白质,很少受到限制。
吴健敏等成功地将大小约215aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面[15]。
令人值得关注的是,SOC与HOC蛋白的存在与否,并不影响T4的生存和繁殖。
SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面,事实上,在DNA包装被抑制时,T4是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体(SOC和HOC也同时组装)。
因此,在用重组T4做疫苗时,它能在空衣壳表面展示目的抗原,这种缺乏DNA的空衣壳苗,在生物安全性方面具有十分光明的前景[16]。
3噬菌体展示技术的应用
噬菌体展示技术的应用包括确定一种蛋白质,将被用作固定化的噬菌体“诱饵”以包括所有的DNA文库的相互作用蛋白的编码序列的细胞,组织或生物体的,从而使功能或机制该蛋白质的功能可以被确定[
17
]。
噬菌体展示技术同时是一种改良蛋白质的方法,利用噬菌体展示技术改造或是开发新的蛋白质,也称为蛋白质工程。
正因为如此,噬菌体展示是一种有用的工具的药物开发工具。
它可以用来发现新的配体,如酶抑制剂,受体激动剂和拮抗剂的目标蛋白质[18-20]。
噬菌体展示技术也可以用来确定肿瘤抗原并用于诊断和靶向治疗。
噬菌体展示技术在研究蛋白质-DNA的相互作用上也有重要的应用。
1991年,斯克里普斯组汇报了噬菌体的第一个显示和选择人类抗体[
21
这一初步研究描述的人类抗体的快速分离的Fab束缚破伤风毒素和方法,然后扩展到快速克隆人类抗HIV-1抗体的疫苗设计和治疗[22]。
抗体文库的噬菌体展示已经成为一种强有力的方法为研究的免疫反应,以及作为一种方法来快速选择和进化的人抗体对于治疗。
抗体噬菌体展示后来由斯克里普斯研究所的卡洛斯·
F.巴尔巴斯创建合成人源抗体库,于1990年获得专利,从而允许在体外合成,创造了人类抗体多元化的元素[23]。
抗体文库的噬菌体展示百万不同抗体通常用在制药工业以分离高特异性的治疗性抗体,以发展为抗体药物主要是作为抗癌剂或抗炎治疗。
其中最成功的是HUMIRA,剑桥大学利用噬菌体抗体技术发现D2E7,雅培制药开发并销售阿达木单抗,这种抗体对肿瘤坏死因子α有治疗作用,是世界上第一个完全人源抗体,年销售额超过10亿美元[24]。
4噬菌体展示技术的局限性
在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装,有的展示系统还要经过跨膜分泌过程,这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。
目前,常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。
不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达,因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合,导致在体内筛选时需外加选择压力。
例如,在噬菌体展示文库试验中,由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解,因此,必须小心控制条件,以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。
另外,鼠源抗体在噬菌体中表达差,也是体内选择压力的一个例子。
真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故[25]。
噬菌体展示文库一旦建成,很难再进行有效的体外突变和重组,进而限制了文库中分子遗传的多样性。
由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达,所以,一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子[26],很难得到有效表达和展示。
5噬菌体展示技术在农药残留分析上的应用
目前噬菌体展示技术已在药学及疫苗研制研究中得到广泛地应用,随着噬菌体展示技术的不断发展,其强大的筛选能力已广泛地应用到免疫学、细胞生物学、药理学、蛋白质工程等诸多领域[27]。
近年来,随着农药小分子免疫检测技术的发展,越来越多的研究者将噬菌体展示技术运用到小分子半抗原及其抗体的筛选中。
5.1农药抗体的筛选
噬菌体展示技术可用来制备重组抗体,从而开发出针对某一种或一类药物的抗体,药物作为半抗原,通过抗原抗体特异性结合的特点,可以开发出小分子免疫残留分析试剂盒,可以用于农药的残留分析。
其具有筛选通量高,试验周期短,效率高,特异性强及亲和选择范围广等特点[28]。
农药小分子检测中,酶联免疫检测法(ELISA)具有简单、快速、选择性好等优点,适用于大量样本的现场快速检测及筛选,目前已广泛应用于农药小分子检测中。
酶联免疫检测法将具有高度特异性的抗原抗体反应与酶对底物的高度催化效应相结合,对受检样品中的酶标免疫反应的实验结果,采用现代光学分析仪器进行光度测定。
它既可以检测抗原,又可以检测抗体,最低检测限可达纳克或皮克水平。
噬菌体抗体库技术在单克隆抗体的制备过程中绕过免疫和细胞杂交融合技术即可获得特异稳定的单抗[29]。
该技术与PCR错配技术、高频率自发突变技术、随机诱变技术、密码子诱变技术、突变库重组技术、链置换技术相结合构建的次级突变基因文库,可以模拟体内细胞免疫反应过程,体外产生高亲和力抗体。
此技术具有简单、高效、生产成本低、筛选范围广、直接得到抗体基因、易于构建各种基因工程抗体等优点。
5.2农药抗体的制备
在农药小分子ELISA方法中,主要包括半抗原的设计与改造,抗原的合成,抗体的制备和检测方法的建立等环节。
其中抗体的制备是关键,目前从天然的或免疫的小鼠脾细胞或杂交瘤细胞提取抗体基因,以改建的噬菌体为载体构建抗体库,与ELISA法相结合,从已构建的展示库中筛选具有针对农药小分子半抗原的特异性抗体已成为研发热点,即对农药小分子半抗原进行设计和改造,合成人工抗原,将抗原包被在酶标板上,然后加入已构建好的待筛选的噬菌体,根据抗原抗体亲和性的大小,经过吸附、洗脱、扩增的筛选过程,从而得到针对农药小分子的高亲和抗体[30]。
利用噬菌体展示技术构建的抗体库可用于农药小分子抗体的筛选,或从特异性较高的偏向性库中筛选具有相同结构的一类小分子抗体。
Barbas等1993年就报道了从半合成抗体库中筛选出3种小分子半抗原的高亲和力抗体Ⅲ3;
Li等也在混合小分子抗体库中筛选出阿特拉津、西玛津、异丙隆、二甲四氯丙酸等4种除草剂小分子半抗原的高亲和力抗体;
Bricheta等亦从构建的天然抗体库中筛出除草剂2,4.D的抗体[31]。
利用噬菌体构建的抗体库还可以用于农药小分子活性产物筛选,利用已知活性物质作为先导化合物制备抗体“探针”,在不同发酵液中捕捉活性物质及其类似物。
在农药小分子免疫检测中,利用已构建好的噬菌体展示库,与ELISA技术相结合,对表现出杀虫活性的混合物质进一步进行筛选,从而得到某种已知或未知的具有活性的农药小分子物质。
6噬菌体展示技术应用展望
噬菌体表面展示技术经历了20多年的发展和完善,在生命科学各领域产生了极其深远的影响。
已被广泛应用于构建筛选特异性单链、单区或更小片段抗体和具有应用价值的新肽和蛋白质类物质,并成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径,一同时也是获取对人类疾病有诊断和治疗价值的生物活性分子的重要手段[32]。
近年来,随着展示技术的不断发展,又出现了酵母表面展示系统和核糖体展示技术,酵母表面展示系统Ⅲ1是继噬菌体展示技术后发展起来的真核展示系统,酵母具有和哺乳动物相似的蛋白质合成机制,且其具有的翻译后的修饰功能可以更好地保持蛋白质的原始三维结构,更好的表达多种功能蛋白质分子,与原核细胞相比,更有利于抗体的亲和力成熟[33]。
核糖体展示技术是一种新型体外筛选和分子进化功能性蛋白质的生物文库技术,最早被用于筛选蛋白靶分子的肽类配体。
自1997年首次被用于完整功能蛋白质的展示以来,在蛋白质结构与功能及蛋白质一蛋白质相互作用,特别是在抗体scFv库的筛选方面取得了极大成功[34]。
与其他筛选方法相比,具有库容量大,易于达到多样化,操作简便,易于筛选,可进行蛋白质体外转化等优点。
不可否认,目前将抗体库技术应用于农药小分子免疫检测中尚处于初步探索阶段,还存在某些不足之处,如库容量的限制,筛选过程中阳性克隆的丢失及假阳性克隆的获得等。
随着近年来酵母表面展示系统,核糖体展示技术,转基因技术等的出现,相信抗体库技术在农药小分子抗原抗体的研究中有着广泛的应用前景。
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