年产1000吨苏氨 酸发酵工艺课程设计文档格式.docx
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无臭,味微甜。
253℃熔化并分解。
高温下溶于水,25°
C溶解度为20.5g/100ml。
等电点5.6。
不溶于乙醇、乙醚和氯仿。
苏氨酸在机体内的代谢途径和其他氨基酸不同,是唯一不经过脱氢酶作用和转氨基作用,而是通过苏氨酸脱水酶(TDH)和苏氨酸脱酶(TDG)以及醛缩酶催化而转变为其他物质的氨基酸。
途径主要有3条:
通过醛缩酶代谢为甘氨酸和乙醛;
通过TDG代谢为氨基丙酸、甘氨酸、乙酰COA;
通过TDH代谢为丙酸和α-氨基丁酸。
1.1.2苏氨酸的作用来源及发展
苏氨酸是一种重要的营养强化剂,可以强化谷物、糕点、乳制品,和色氨酸一样有缓解人体疲劳,促进生长发育的效果。
医药上,由于苏氨酸的结构中含有羟基,对人体皮肤具有持水作用,与寡糖链结合,对保护细胞膜起重要作用,在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。
其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝药用效能,是复合氨基酸输液中的一个成分。
同时,苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素——单酰胺菌素的原料。
苏氨酸用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
特别是饲料添加剂方面用量增长快速,它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中,是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。
随着人民生活水平的提高和养殖业的发展,苏氨酸作为饲料用氨基酸,广泛用于添加仔猪饲料、种猪饲料、肉鸡饲料、对虾饲料和鳗鱼饲料等。
主要食物来源:
发酵食品(谷物制品)、鸡蛋、茼蒿、奶、花生、米、胡萝卜、叶菜类、番木瓜、苜蓿等。
苏氨酸的生产方法主要有发酵法,蛋白质水解法和化学合成法三种,目前微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法。
长期以来,国际市场对苏氨酸的需求持续稳定增长,是需求增长最快的氨基酸品种之一,特别是在化学及生化、食品添加剂、饲料添加剂等方面的用量增长快速,大有取代色氨酸而成为除赖氨酸、蛋氨酸以外的发展最迅速的第三大氨基酸。
目前全世界苏氨酸的需求量不应低于8万t/年,缺口较大,且每年将以10%~12%的速度递增。
苏氨酸发酵法菌种来源有大肠杆菌、短杆菌、谷氨酸棒杆菌等。
2菌种的选择与制备
2.1菌种选择与保藏
2.1.1菌种选择
关于菌种的选择,通过查资料工业一般使用大肠杆菌基因工程,因其产量大,没有反馈抑制,本设计采用大肠杆菌基因工程菌发酵工艺来生产苏氨酸,所以对于菌种来源需要从菌种机构来买。
2.1.2菌种保藏
菌种保藏的原理:
通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,以最大限度的降低菌种的代谢强度抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止,生命活动将处于休眠状态,从而可以保藏很长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活和繁殖能力,不发生形态特征、生理状态以及遗传性状的改变外,还不允许污染任何杂菌。
此外,保存前应确保菌种的单纯性,先分离单菌落后进行鉴定,然后再繁殖保存。
菌种常用的保存的方法有斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。
从菌种机构买回来的菌种,为了保证每次接种的菌种稳定,需要对菌种进行扩大并保藏,将菌种接种于LB培养基,稳定培养24h,将所得的菌用甘油冷冻保藏法于-70度保藏。
使用时将菌种表面部分融化,挑取少量于摇瓶培养基中,注意菌种不要全部融化,摇瓶培养所得置于冰箱中供菌种扩大使用。
2.2培养基的设计
2.2.1培养基配置的原则
培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料,同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。
原则上①满足必须的原料;
②生化反应的基本条件(温度、溶氧和pH);
③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定;
④培养基成分不影响下游产品的提取加工。
2.2.2培养基类型
培养基可以按照用途可以分成,菌种扩大培养基,摇瓶培养基、种子培养基和发酵培养基。
(1)LB培养基
LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养
菌种,使菌种成倍扩增,达到使用
(2)摇瓶培养基
孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基,对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。
(3)种子培养基
种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体,并使菌丝体长的粗壮,成为活力强的“种子”。
(4)发酵培养基
发酵培养基既要有利于生长繁殖,防止菌体过早衰老,又要有利于产物的大量合成。
要求培养基的组成应丰富、完全,碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配,少用速效营养,多加迟效营养,还要考虑适当的碳氮比,加缓冲剂稳定pH值;
并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。
由于本课题为工业发酵生产,所以选择培养基配料时要注意到经济成本,选用廉价发酵原料根据本地条件,结合实际情况,可选用合适的碳源和氮源。
采用葡萄糖作为主要的碳源,玉米浆作为底料的氮源,玉米浆除能提供必需的氮源外还含有利于产酸的有益生长因子,同时辅以适量的无机盐和其他微量元素。
大肠杆菌的培养基配方及其培养条件
2.2.3培养基配方(百分比)
LB培养基
胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L调节pH到7.4
摇瓶培养基
葡萄搪0.5,牛肉膏1.0,蛋白胨1.0,NaCl0.5,调节pH值在7.0~7.2之间。
种子培养基
葡萄糖3.5,玉米浆1.5,(NH4)2SO40.5,MgSO40.05,KH2PO40.1,CaCO31。
溶解后以NaOH调至pH7.0。
发酵培养基
葡萄糖12~14,玉米浆3.0,(NH4)2SO43.5KH2PO40.1,MgSO40.1,CaCO32,以NaOH调pH至7。
补料培养基
葡萄糖15玉米浆3.0(NH4)2SO42.0以上培养基均在121℃下灭菌20min。
2.2.4培养方法:
在32℃培养18~24h经质量检查合格后,即可利用火焰接种法接种于种子罐。
种子培养基
接种时以1%的接种量接种于2000L种子罐,搅拌转速300~700r/min,通过自动添加氨水控制pH在7.0。
一般培养18~20h,取菌种,分析其pH、残糖、菌体密度及镜检正常后可供发酵罐接种用,利用压差法接种于发酵罐。
发酵培养基
接种时以10%的接种量接种于20000L标准发酵罐中,其装液量为15000L。
罐内培养条件为:
温度32℃,气压l00KPa,通风比前期1∶0.2,中后期1∶0.3,搅拌300r/min,加泡敌作消泡剂。
分批补料发酵周期为60h
补料培养基
在发酵培养基培养12h后,当总糖浓度低于5.5%时,开始补料,补料计量根据发酵液情况而定。
2.3培养基的营养要求
碳源
主要以淀粉水解糖作为碳源,生产过程中应注意控制其浓度,当碳源浓度
过高时,对菌体生长不利,氨基酸的转化率降低。
氮源
包括铵盐、尿素、氨水等,同时有调节pH值的作用。
对于营养缺陷型菌
株应以添加有机氮源水解液为主。
需生物素和氨基酸时,应以玉米浆作氮源。
尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐,须单独灭菌。
可分批流加。
氨水用pH自动控制连续流加。
此外,还应注意合适的C/N比。
磷酸盐
对发酵有显著影响,不足时糖代谢受抑制,要根据菌种不同的培养及生产阶段及时的调整用量。
镁
镁是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂,并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。
可通过添加MgSO4防止发酵过程中的缺乏。
钾
钾可以促进糖的代谢,钾的量较多时利于产酸,钾的量较少时利于菌体生长。
可以根据不同的目的和需要调整钾的用量。
其他微量元素钠可调节细胞内外的渗透压,一般在调节pH值时加入。
锰是许多酶的激活剂。
而铜离子则对氨基酸发酵有明显毒害作用
生长因子
生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物
质。
水
水是生命活动不可或缺的物质,是细胞的主要成分,良好的介质,营养传递的道体,调节细胞生长。
2.4发酵条件的研究
细菌生长曲线可划分为四个时期,即:
①延迟期,②对数生长期,③稳定期,④衰亡期。
生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中,生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。
生长曲线各个时期的特点,反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流,以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。
深入研究各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特点与内在机制,在微生物学理论与应用实践中都有着十分重大的意义。
处于对数生长期的细胞,由于代谢旺盛,生长迅速,代时稳定,个体形态、
化学组成和生理特性等均较一致,因此,在微生物发酵生产中,常用对数期的菌体作种子,它可以缩短延迟期,从而缩短发酵周期,提高劳动生产率与经济效益。
对数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。
因此如果确定了菌体的生长曲线,那么就可以选择合适的时间接种,从而达到虽好的发酵效果。
在发酵的过程中,苏氨酸产量会随时间呈曲线变化,在某一段时期内菌体产苏氨酸的量会达到最大值,这个时间段就是最佳的发酵时间。
2.5灭菌
所谓灭菌,就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。
2.5.1灭菌方法
灭菌,就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。
常用的灭菌方法有以下几种:
(1)化学药剂能使微生物中的蛋白质、酶及核酸发生反应而具有杀菌作用,如甲醛、氯、高锰酸钾、环氧乙烷等。
(2)紫外线灭菌:
波长为(2.1~3.1)×
10-7m的紫外线有灭菌作用,最常用的波长为2.537×
10-7m的紫外线,但紫外线的穿透力低不适用于培养基灭菌。
(3)干热灭菌的条件为在160℃下保温1小时。
适用于一些要求干燥的实验器具和材料的灭菌。
(4)湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌。
通常的蒸汽灭菌条件为在121℃
(表压约0.1MPa)维持30分钟。
2.5.2培养基的湿热灭菌
本实验采用湿热灭菌,条件为在121℃(表压约0.11MPa)维持30分钟。
对培养基进行湿热灭菌时,培养基中的微生物受热死亡速率与残存数量成
正比,即
式中:
培养基中活微生物的个数;
τ为微生物受热时间,s;
κ为比死亡速率;
上式被称为对数残留定律。
其中N为经τ时间灭菌后培养基中活微生物数。
连续灭菌将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程。
分批灭菌就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中,通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程,也称实罐灭菌。
分批灭菌是中小型发酵罐常用的一种灭菌方法。
分批灭菌的优点是不需要专门的灭菌设备,投资少,设备简单,灭菌效果可靠。
分批灭菌的缺点是发酵罐占用时间长,培养基的营养成分破坏程度较大。
连续灭菌流程图如图2-1所示。
图2-1连续灭菌的流程图
由于本设计使用的发酵罐较小所以本生产利用分批灭菌即实罐灭菌的方法。
2.5.3分批灭菌
分批灭菌是指将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中,通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间,再冷却到接种温度,也叫间歇灭菌、实罐灭菌。
实罐灭菌无需专门的灭菌设备,灭菌效果可靠,对灭菌用蒸汽要求低(0.1-0.3MPa)。
实罐灭菌是中小型发酵罐常采用的一种培养基灭菌方法。
在进行培养基灭菌之前,通常先把发酵罐空气分过滤器灭菌并用空气吹干。
进料后,开动搅拌以防止沉淀。
然后开启蒸汽阀,缓慢引进蒸汽,使料液升温至80℃左右后关闭蒸汽阀门。
开三路(空气、出料、取样)进汽阀,开排汽阀。
当温度升到110℃时,控制进出汽阀门直至121℃(表压0.1-0.15MPa),开始保温,一般保温20min。
保温结束后,关闭过滤器排气阀、进气阀。
关闭蛇管下水道阀,开启冷却水进回水阀。
待罐压低于过滤器压力时,开启空气进气阀引入无菌空气。
随后引入冷却水,将培养基温度降至培养温度。
2.5.4分批灭菌的操作方法
首先确认蒸汽发生器的各开关都处于正常状态,向发酵罐内加入水,将蒸汽发生器打开,然后检查发酵罐的各个开关是否都处于关闭状态。
清洗罐内,用自来水冲洗,并且取下pH电极,pH电极使用前要进行校正,校正方法与一般电极相同,校正完成后插上电极。
确认排料口已经关闭,向罐内注入培养基,然后旋紧加料口盖,打开搅拌,搅拌速度为200r/min。
打开蒸汽发生器的蒸汽输出阀门,打开发酵罐的蒸汽通路总阀和排料口的蒸汽阀,排尽管路中残存的冷凝水,等出料口只有水蒸汽冒出时,就说明冷凝水排尽,此时关闭排料口的蒸汽阀门,打开通入夹套中的蒸汽阀门,与排污阀,控制夹套中的压力,使其处于0.11MPa左右,罐内的温度会迅速上升,等温度达到95℃时就可以关闭搅拌了,此时罐内的培养基已经沸腾无需搅拌,混合的效果已经很好,同时要开始控制罐顶端的排气阀,先全开,以排尽罐内的空气,然后适当关小此阀,使罐内的压力略大于大气压。
当温度达到121℃时,实罐灭菌开始计时,同时控制罐压和夹套内的压力,温度才能维持在121℃。
至此,实罐灭菌过程完成。
2.5.5空气除菌
大多数生物培养基都需要氧气,通常以空气作为氧源。
根据国家药品生产质量管理规范(GMP)的要求,生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。
过滤是空气除菌的主要手段,按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类:
绝对过滤和相对过滤。
过滤介质有棉花、玻璃纤维、活性碳等。
2.5.5.1过滤除菌流程及设备
流程如下:
采风塔——空气粗过滤器——空气压缩——机储气罐——冷却器——旋风分离器——冷却器——丝网除沫器——空气加热器——总空气过滤器。
设备如下:
(1)采风塔:
采风塔建在工厂的上风头,高至少10米,气流速度8m/s。
(2)粗过滤器:
主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机,同
时起一定的除菌作用,减轻总过滤器的负担。
(3)空气压缩机:
作用是提供动力,以克服随后各设备的阻力。
(4)空气储罐:
作用是消除压缩空气的脉动。
要求:
H/B=2~2.5,V=(0.1~0.2)V1其中,H为罐高;
B为罐直径;
V1为空压机每分钟排气量(20℃,1×
105Pa状况下)。
(5)旋风分离器:
是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。
作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。
(6)冷却器:
空压机出口温度气温在120℃左右,必须冷却。
另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。
(7)丝网除沫器:
可以除去空气中绝大多数的20µ
m以上的液滴和1µ
m以上的雾滴,一般采用规格为直径0.25㎜×
40孔且高度为150㎜的不锈钢丝网。
(8)空气加热器:
列管内走空气,管外走蒸汽。
(9)总过滤器:
填充物按下面顺序安装:
孔板→铁丝网→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→铁丝网→孔板。
介质要紧密均匀,压紧一致,上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4,间活性炭层为1/3。
空气除菌的目的是出去空气中的微生物,关键在于保证介质的干燥,要求空气湿度小于50%。
气净化系统流程,如图2-2所示。
图2-2空气净化系统流程图
2.5.5.2无菌空气的检测
现在采用的无菌实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法这里我们采用斜面培养法来检查。
具体方法如下:
500mL三角瓶内装斜面培养基50mL,其组成为可溶性淀粉2%,黄豆饼粉
1%,K2HP040.25%,NaCI0.2%,MgS040.05%,CaC030.3%,琼脂
1.8%,pH6.5~7.0,接种后置旋转式摇床,(30±
1)℃下培养28h左右备用。
接种于斜面上,培养24h后观察有无菌落。
2.6种子扩大培养
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。
本发酵属于一级种子罐扩大培养,二级发酵。
设计流程如下:
菌种——锥形瓶——种子罐——发酵罐
2.6.1生产车间种子制备
将生产菌种悬浮液用火焰接种法接入种子罐进行扩大培养,种子罐接入发酵罐采用压差接种法。
种子罐级数确定的原则:
①保证种子量足够,满足生长需求。
②尽量减少级数,简化工艺,减少污染。
种子罐培养的目的是使种子量增大,以缩短发酵罐的发酵延滞期。
大肠杆菌基因工程菌,因其生长速度较快,产苏氨酸采用一级种子罐,也称二级发酵。
若取接种量为10%。
种子罐用一个。
种子罐的体积按照接种量来确定
2.6.2影响种子质量的因素
影响种子质量的因素有原材料的质量,培养条件(温度、湿度、通气量)和斜面冷藏时间。
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象,其主要原因是原材料质量波动。
原材料质量的波动,起主要作用是其中无机离子含量不同。
种子质量的控制可以通过菌种稳定性检查,无菌检查,保证原材料质量和控制培养条件等。
3发酵过程的工艺控制
3.1发酵过程
微生物发酵过程可分为:
分批发酵、补料-分批、半连续(发酵液带放)和连续发酵。
分批发酵是一种准封闭式系统。
连续发酵是在发酵过程中一边补入新鲜的料液,一边以相近的流放速放料,维持发酵液原来的体积。
本生产采用补料-分批发酵,即在分批发酵(一次性加入发酵罐内等发酵完全后放罐)的基础上,加入新鲜的料液,也克服由于养分的不足导致发酵过早结束。
3.1.1补料的控制
在发酵培养基培养12h后,当总糖浓度低于5.5%时,开始补料,后每4小时补一次,每次10-15L。
发酵培养基培养10h~18h,控制总糖浓度
6.5%~8.5%。
发酵培养基培养19h~24h,控制总糖浓度5.0%~6.3%。
发酵培养基培养40h后,控制总糖浓度4%~5%。
当pH小于6.7时,补加氨水,使pH维持在6.7左右,控氨水平在45mg/100ml以上。
3.2发酵条件的影响
苏氨酸的发酵生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件(包括培养基)的控制)。
其中发酵条件包括:
发酵温度、溶氧、PH、培养基营养成分等。
3.2.1初始pH对苏氨酸影响
初始pH值影响菌件对基质的利用速度和细胞的结构状态,以致影响菌体生长速度和代谢产物的变化。
对pH值的适应范围缺定于微生物的生忐学,每种微
生物都有自己的生长最适pH值,如果培养液的pH值不合适,则微生物的生长
就要受到影响。
不仅不同种类的微生物对pH值的要求不同,就是同一种微生物,由于pH值的不同也可能形成不同的产物。
另外,微生物生长的最适pH值往往不一定相同。
苏氨酸生产菌的最适pH为7.0,菌体的呼吸作用最强。
3.2.2温度对苏氨酸发酵的影响
菌体的生长和合成抗生素的代谢活动都是在各种酶的催化下进行的,然而酶的催化作用需要有适当的温度。
从酶反应动力学来看,随着温度的升高,酶的活性加强,反应速率加大,生长代谢加快,抗生素分泌期提前,但温度过高,则酶易失去活性,菌体易迅速衰老,发酵周期缩短,抗生素产量就降低,因此维持产生菌的生长和合成抗生素所需要的最适温度是苏氨酸发酵的重要条件。
研究表明,大肠杆菌最适温度为37度,在发酵中后期,温度转换至39℃对L-苏氨酸发酵有促进作用。
3.2.3溶氧对苏氨酸发酵的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是最重要的参数之一。
微生物深层培养时,需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成,氧的不足会造成代谢异常,产量降低。
微生物发酵的最适氧浓度与临界氧浓度是不同的。
前者是指溶解氧浓度对生长或合成有一最适的浓度范围,后者一般指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。
为了避免生物合成处在氧限制的条件下,需要考察每一发酵过程的临界氧浓度和最适氧浓度,并使其保持在最适氧浓度范围。
溶氧对发酵的影响及其控制:
工业发酵微生物多数为需氧菌,少数为厌氧菌;
需氧菌发酵过程,发酵液中溶氧浓度的控制是重要的控制参数之一;
对维生素发酵来说,氧的供给更为重要。
溶氧异常下降可能原因有:
一是污染好气性杂菌,消耗大量溶氧;
二是菌体代谢发生异常现象,需氧要求增加,使溶氧下降;
三是某些设备或工艺控制发生故障或变化,引起溶氧下降等。
本设计为需氧发酵需通入较多无菌空气。
本设计中要求溶氧为20%,通过控制罐压和通气量进行调节。
3.2.4发酵过程泡沫的控制
起泡会带来许多不利因素,如发酵罐的装料系数减少,氧传递系统减少等。
泡沫过多时,影响更为严重,造成大量逃液,发酵液从排气管路或轴封逃出而
增加染菌机会等,严重时通气搅拌也无法进行,菌体呼吸受到阻碍,导致代谢
异常或菌体自溶,所以,控制泡沫是保证正常发酵的基本条件。
泡沫的制,可以采用两种途径:
1调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物化参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会。
但这些方法的效果有一定的限度;
2采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫。
还可以采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种,来消除起泡的内在因素。
3.3发酵终点的判
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