肉鸡的疾病诊断实验报告分析.docx
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肉鸡的疾病诊断实验报告分析.docx
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肉鸡的疾病诊断实验报告分析
肉鸡的疾病诊断
预防兽医学陈新诺,马艳君,张兴民,薛照越,夏宾雁
畜主:
刘女士
主诉:
地养了8800只肉鸡,现16日龄,3日龄时接种用禽流感、新城疫疫苗后(当天气温降低),鸡群出现了咳嗽等症状,投氟苯尼考、泰勒菌素、银翘散等药物进行治疗,12日龄再次接种禽流感、新城疫苗,并接种鸡痘苗,13日龄时咳嗽、伸颈呼吸等呼吸道症状严重,排白色糊状粪便,近来3天左右每天死亡10~30只鸡,采食饮水状况无明显变化,精神较沉郁,发病率为5~6%左右,发病死亡率呈上升趋势。
免疫状况:
3日龄穿刺接种用禽流感、新城疫疫苗;12-13日龄再次接种禽流感、新城疫苗,并接种鸡痘苗。
病例解剖:
对送检的7只鸡进行解剖观察,发现在气管和嗉囊中有少量的粘液,气管有轻微的出血现象;腺胃乳头有不明显的的出血点,其他部位没有明显的病变。
由于不能确定引起此次疾病是细菌还是病毒,所以参照能引起呼吸道症状的疾病的资料,我们对送检病鸡进行解剖,采集主要的靶器官(脾脏,肝脏,肺脏,脑组织,气管)进行了细菌和病毒的分离鉴定。
一、细菌的分离及生化鉴定
病料:
送检的病鸡的肝脏,脾脏,肺脏。
主要试剂:
TSA+10%犊牛血清,生化鉴定管。
细菌的分离:
用接种环蘸取在无菌条件下从肝脏、脾脏、肺脏实质器官分离病原,接种于含10%犊牛血清的TSA培养基上,37℃培养,二天观察细菌生长情况,将细菌按菌落形态大小分类,见表1,表2。
表1菌落形态结构特征(TSA+10%犊牛血清37℃18h)
肝脏:
表1-1
编号
形态特征
7-8
金黄
1~2mm
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
7-7
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
7-10
淡黄
小于1mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
3-2
金黄
针尖大小
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-2
金黄
针尖大小
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-4
淡黄
1mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-5
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
1-1
金黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
3-1
金黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
2-2
淡黄
针尖大小
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
脾脏:
表1-2
编号
形态特征
3-4
淡黄
针尖大小
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
3-5
淡黄
针尖大小
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
3-6
淡黄
针尖大小
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
3-7
淡黄
针尖大小
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-1
淡黄
针尖大小
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
4-2
淡黄
1mm
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
1-1
金黄
1~2mm
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
3-1
半透明
1~2mm
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
7-5
半透明
针尖大小
边缘不齐,表面光滑,湿润,扁平
肺脏:
表1-3
编号
形态特征
2
半透明
小于1mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
6-1
半透明
小于1mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
7-1
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
3-1
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
3-2
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
3-3
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
7-3
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-8
淡黄
1~2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-9
半透明
1mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-10
半透明
1mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
4-11
淡黄
2mm
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
1-1
淡黄
针尖大小
边缘整齐,表面光滑,湿润,扁平
从表1我们可以得出每一只鸡都有实质器官分离出细菌,主要有7种,见表2。
表2细菌形态特征总结
形态特征
编号
数量
(株)
淡黄色
针尖大小
边缘不齐
表面光滑湿润扁平
脾3-4,3-5
2
半透明
小于1mm
边缘整齐
表面光滑湿润扁平
肺2,4-9,4-10,6-1
脾7-5
5
淡黄色
针尖大小
边缘整齐
表面光滑湿润扁平
肺1-1
脾3-6,3-7
3
金黄色
针尖大小
边缘整齐
表面光滑湿润扁平
脾3-3
肝4-2,7-8
肺3-2,7-3,
5
淡黄色
1mm左右
边缘整齐
表面光滑湿润扁平
脾3-6,4-1
肝4-2,4-4
4
淡黄色
1~2mm
边缘整齐
表面光滑湿润扁平
肝7-7,4-5
肺3-1,3-2,3-3,
4-8,4-11,7-1,7-3
9
根据形态结构特点,挑取具有不同形态并且具有一定数量的单菌落进行革兰染色,染色结果如表3。
表3细菌革兰染色结果
肝脏:
表3-1
编号
G+阳性/阴性G-
形态
排列方式
3-1
G-
杆菌、球菌
成堆
3-2
G-
球菌
成堆、链状
3-3
G-
短杆菌
散在
7-7
G-
球菌
成堆
7-8
G+
球菌
成堆
7-9
G+
球菌
链状
7-10
G-
杆菌
链状
4-6
G+
球菌
链状
4-7
G-
短杆菌
成堆
4-3
G+
球菌
链状
4-4
G+
球菌
链状
4-5
G+
球菌
成堆、链状
2-1
G+
球菌
成堆、链状
2-2
G+
球菌
成堆、链状
脾脏:
表3-2
编号
阳性G+/阴性G-
形态
排列方式
3-1
G-
短杆菌
成堆
3-2
G+
球菌
成堆、链状
3-3
G+
球菌
成堆
7-4
G+
球菌
散在
7-5
G-
短杆菌
散在
7-6
G-
短杆菌
散在
肺脏:
表3-3
编号
阳性G+/阴性G-
形态
排列方式
3-1
G-
杆菌
成堆、单个都有
3-2
G-
杆菌
多散在分布
3-3
G-
短杆菌
成堆
7-1
G+
球菌
散在
7-2
G+
杆菌
散在
7-3
G+
球菌
成堆
4-8
G-
球菌
散在
4-9
G-
杆菌
链状
4-10
G-
杆菌
链状
4-11
G+
球菌
成堆
通过染色结果我们发现,所分离的细菌主要分为革兰阳性(G+)球菌,革兰阴性(G-)球菌,革兰阴性(G-)杆菌三种,其中G+球菌有15株,G-球菌有3株,G-杆菌有12株。
取单菌落连续纯化至第三代,将纯化后的细菌,挑取具有代表性的进行生化鉴定试验。
根据菌落形态和染色结果,我们挑取7株(脾3-4,肺2,肺1-1,肺3-1,脾3-3,肝4-4,肝7-7)具有代表性的细菌进行生化鉴定。
生化鉴定结果编号分别为00161,01775,01511,41777,01517,01745,00513,对照肠杆科细菌生化鉴定编码使用说明进行细菌种类查找,均未能找到相对应的编码,所以没能确定细菌的种类。
这可能是由于所挑细菌并不是纯培养或者进行结果判定时主观性太强所致。
虽然并未鉴定出有哪些种类的细菌,但我们从实质器官中分离得到了细菌,证明这些细菌为致病菌,本实验发现G+细菌和G-细菌数量一样多,且同一个样本中可以感染阳性阴性两大类细菌,说明鸡群的细菌感染较为严重。
二、病毒检测及鉴定
1病毒学检测
1.1试验材料与方法
取送检病鸡7只,无菌采集脑组织,气管,肺脏,肝脏,脾脏。
分别编号1~7号,取1~7号的脑组织进行病毒的检测。
1.2实验步骤:
(1)病料处理
剪取一小块组织病料放入4ml离心管中,剪碎按1:
3比
例加入PBS,用高速涡旋器将其制成悬液。
将上述悬液样品反复冻融3次之后,3000r/min离心
30min将上清液转移到新的离心管中备用。
(2)病毒RNA提取及反转录
①在1.5mL的离心管中加入刚离心过病毒原液300μL,再加入TRIzolLS700μL,充分混匀,室温放置10min;
②加入200μL的氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡离心管
③在4℃条件下,13000r/min离心15min,取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相);
④加入等体积异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,室温放置10min;
⑤4℃,13000r/min离心15min用枪小心吸去所有上清;
⑥1mL75%乙醇洗一遍,4℃,10000r/min离心10min,用枪小心吸去所有上清,在超净台中干燥5min;
⑦加入20μLDEPC处理水溶解沉淀。
(3)反转录(10ul体系)
表4反转录体系
试剂剂量
5×Buffer2.0ul
ddH2O4.5ul
RT酶0.5ul
引物1.0ul
反转录其条件:
37℃15min,85℃15s,16℃10min。
转录产物于-20℃保存。
(4)反转录产物进行PCR扩增
用4对PCR扩增引物,禽流感H5,H9引物,流感病毒引物,新城疫病毒引物
表5引物信息表
引物名称序列目的基因片段
新城疫上游引物5’-ACCAAAGAGAATCTGA-3’330bp
新城疫下游引物5’-GACAGTCCCACTGGTCTC-3’
H1N1-M基因上游引物5’-TACTAAGGCTTTGGGAG-3’228bp
H1N1-M基因下游引物5’-CTACTAAGGCTTTGGGGAA-3’
禽流感H9上游引物5’-GTCAGGATTAGTTGCTGGTTGG-3’540bp
禽流感H9下游引物5’-GATGAGGCGACAGTCGAATA-3’
禽流感H5上游引物5’-CGAATCCAATGACC-3’306bp
禽流感H5下游引物5’-TCTATGGCAACCGTTCTT-3’
PCR扩增反应条件如下:
94℃预变性4min;94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s,共40个循环;72℃延伸8min。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,并用凝胶成像系统观察记录结果。
(5)结果见图1
1图分别为新城疫、禽流感H1、禽流感H5禽流感H9检测结果:
新城疫:
无阳性
禽流感H1:
3、6为阳性,500bp左右
禽流感H5:
无阳性
但由于图中阳性条带均不是目标条带,所以不能判定其是否为新城疫或禽流感病毒的感染,且由于之前鸡群接种过疫苗,所以还需要进一步试验来验证。
2鸡胚攻毒实验
由于该鸡群接种过新城疫、禽流感疫苗,所以PCR鉴定结果的阳性不能判定是野毒感染还是由于疫苗的作用,于是为了鉴定是否为野毒感染,我们采用接种SPF鸡胚方法,回收尿囊液,测定病毒的凝血效价来进行判定。
2.1材料与方法:
10日龄SPF鸡胚18枚,分别接种从脑组织提取的病毒7枚,从气管提取的病毒7枚,4枚空白对照。
尿囊腔接种
标记气室与胚胎位置,并在胚胎面与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记,此即为注射点。
将鸡胚竖放在卵杯上,钝端向上。
消毒气室的蛋壳,用开孔器钻开一长约2mm小口。
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