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5.等电点的定义?
蛋白质在等电点时有哪些特点?
当溶液的pH为一定数值时,其中的蛋白质正负电荷相等,即净电荷为零,此时的pH
值就是该蛋白质等电点pI。
蛋白质在等电点时的溶解度最小。
6.
下列不是区带电泳的是(C)
7.等电聚焦与等速电泳的差别?
答:
区带窄,分辨率高。
按支持命质的不同可分为:
.■(I)纸电泳(PdiperfhctnjphoFkM)
⑵醋酸纤维歳薄膜电冰(CtlluhscAcuateelectrftphoresis}
⑶琼胎罄凝胶迫泳(Agii『Gelelectruphoresh)
⑷聚丙烯ffifeSt胶电泳(PolyamlamldeCd«
tecirophortsls)(PAGE)
⑸需m—聚丙晞酸胺凝胶电冰(SI)S-PAGE)
底则丄按电秋的分离原艸采分口可分为・三类:
□自由界面电沐
1纸电冰
醋酸紆維盍薄膜电汰
J区蹙脱<
滾粉社胶电汰
琼脂糖礙胶电沐
'
聚丙烯醯瞳漲胶41冰
按支持介质形状不同可分为*J轉連巾球
⑴薄层电沐:
⑵板电涼:
⑶柱电泳:
⑷匸舉:
Z:
散电秋自由界面电泳:
部分分离
半围相或胶狀介战
点样->
加电场
各成分分离成越立的区带
各区带用架色着方法显示
点样加电场棘黨焦
点样>
由冬种目有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度
各区带分成淸晰界面
与等速电沐的差别?
特点:
区带準,分辨率禹
8•电渗现象:
外加电场作用下,与固体支持物接触的液体层发生移动的现象。
电渗流:
电渗现象中液体的整体流动。
是毛细管电泳分离的主要驱动力,是毛细管中的溶剂
因轴向直流电场作用发生的定向流动。
其大小直接影响分析结果的精确度,准确度。
9.(凝胶电泳)为什么要用支持介质?
支持介质应具备哪些特性?
抗对流;
抗扩散。
物理化学性质稳定;
化学惰性一一不干扰大分子的电泳过程;
均匀,电内渗小,结果重复性好。
10.两大类支持介质薄膜类和凝胶类的特点?
薄膜类化学惰性好,能将对流减到最小;
分离主要原理:
生物大分子的电荷密度。
凝胶
类高粘度和摩擦阻力?
对流和扩散都小;
具有分子筛作用。
电荷密度+分子
大小。
凝胶屯泳的支持介质比较
优点
缺点
低帼泳
设备探作向单
分舞率蓋”电
泳
设畚操作简啊.祥品用星步
分殊率差
快速.分済率肩
申漫聊舐严底
聚内烯旣肢凝胶
町iww凝胶扎径.样酩用塑
电泳
少分辨率為.无电潘观皺
剥离
11.在聚丙烯酰胺凝胶方法中,引发剂和加速剂的作用?
引发剂:
提供原始自由基,通过自由基传递,使Acr成为自由基,启动聚合反应。
加速剂:
加快引发剂释放自由基的速度。
Bis是交联剂。
聚丙烯酰胺凝胶的特点
(1)孔径大<
1、与生物大分子大小相似且凝胶孔径可调书,有良好的分子筛效应:
⑵在一定浓度范围内,凝胶透明,有弹性,机械性能好:
(3)化学性能稳定;
⑷对pH和温度变化较稳楚;
⑸分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体;
⑹儿乎无吸附和电淒作用,只要Mr纯度高,操作条件一致.则样品分离重复性好,
⑺样品不易扩散,且用量如其灵敏度可达10理。
12.决定PAG特性的主要因素:
单体和交联剂的总浓度;
单体和交联剂的比例。
凝胶总浓度一定时,Bis的含量影响凝胶孔径。
PAG的分子筛效应取决于凝胶孔径与样品分子大小接近的程度。
选择合适的凝胶浓度,完成不同的分离任务。
a:
b<
10凝胶脆、硬,呈乳白状;
b>
100凝胶呈糊状;
b~30凝胶富有弹性,且完全透明;
a<
2%和b<
0.5%凝胶不可能聚合。
什么是分子筛效应?
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。
分子量小,阻力小,移动快;
分子量大,阻力大,移动慢。
醋酸纤维素薄膜电泳的特点是什么?
分离速度快、电泳时间短、样品用量少。
因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
简述聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及应用范围。
特点:
具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小
(1卩g〜100卩g)、分辨率高等。
应用范围:
可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。
还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS),以测定蛋白质亚基的相对分子质量。
13.聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么优点?
(1)可以在天然状态分离生物大分子;
(2)可分析蛋白质和别的生物大分子的混合物;
(3)电泳分离后仍然保持生物活性。
14.琼脂糖凝胶的特点:
(1)属于大孔胶。
可以分析107的大分子,其电泳分辨率低于PAGE的。
琼脂糖浓度决定形成凝胶后的孔径。
(2)物理化学性质稳定,吸附小,分辨率高,重复性好;
(3)机械强度较高;
(4)琼脂糖无毒,热可逆,制备简单;
(5)利于样品回收;
(6)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,染色、脱色程序简单快速。
15简述电泳的基本操作。
一,安装膜具;
装封胶条,注意封胶条平面朝下,不能有裂口;
盖上凹玻璃;
将凹玻璃冲外装进槽里;
将楔子插进,将底部插紧。
二,配制凝胶溶液三,灌胶,加到顶部,来回倾斜去气泡四,样品制备。
五,加样:
通过电极缓冲液,小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。
六,电泳
七,剥胶:
电泳结束后,取下凝胶模,卸下胶框,用凝胶铲小心撬开短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记.
八,染色与脱色
16..电泳技术的优点:
快速、准确、重现性好。
(1)电泳性质高度特异性;
(2)电泳方法温和性。
17.常见的不正常电泳现象有:
涂抹痕迹;
条纹拖尾;
条带变浅;
前段指示剂缺失;
条带仅在凝胶顶部;
混杂因素等。
等电聚焦电泳:
18.IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。
等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质,当通以直流电时,两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度,在此体系中,不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上,也就是说被聚焦于一个狭的区带中,电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。
19.IEFE的特点?
优点:
1.分辨率高(精密度可达0.01pH单位),灵敏度高(最低检出量达0.1ng)。
2.电泳区带相当狭窄。
3.重复性好。
缺点:
1.要求用无盐溶液,而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI,不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。
20.进行IEFE必须具备3个条件:
1有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度
2有一个抗对流的电泳材料,使已经分离的样品不再重新混合
3电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
在电泳介质中放入载体两性电解质,当通入直流电时,两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,正极附近是低pH区,负极附近是高pH区。
21.理想的载体两性电解质应具备的特征:
1分子量要小,以便与被分离大分子物质分离;
2化学性质稳定;
3各成分的pI彼此接近,并在其pI值附近有良好的缓冲能力;
4在pI处具有足够的电导,导电性均匀;
5两性电解质载体的数目要足够多;
6可溶性好;
7对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度,不干扰样品的测定。
简述等电聚焦电泳的限制条件。
(1)要求用无盐溶液,而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀;
(2)样品中的成分必须停留在其pl,不适用在pl不溶或发生变性的蛋白质。
列举几个等电聚焦电泳的应用。
(1)分析分离制备蛋白质、多肽:
①区分人血清蛋白;
②测出异常免疫球蛋白;
③基
因分型
(2)测定pl可鉴定蛋白质、多肽;
(3)双相电泳中,lEFE作为第一相。
理想的载体两性电解质应具备的特征有?
(1)分子量要小,以便与被分离大分子物质分离;
(2)化学性质稳定;
(3)各成分的pI彼此接近,并在其pI值附近有良好的缓冲能力;
(4)在pI处具有足够的电导,导电性均匀;
(5)两性电解质载体的数目要足够多;
(6)可溶性好;
(7)对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度,不干扰样品的测定。
SDS-PAGE
22.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:
是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠)。
它是根据SDS和还原剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小,在恒定pH(碱性)缓冲系统的分
离。
主要用于测定蛋白质亚基分子量。
23.SDS电泳的迁移速率主要取决于分子大小,为什么?
SDS是一种阴离子去垢剂,SO32-带负电荷。
因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与
SDS分子结合时,可形成SDS-蛋白质复合物。
这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS,
蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
24.SDS的其他作用包括:
阴离子去污剂:
作为变性剂和助溶性试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂:
断裂二硫键。
25•样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度十分重要,影响它们结合的因素主要有三个:
⑴溶液中SDS单体的浓度:
SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在的,能与蛋白质结合的是单体。
单体的浓度与SDS总浓度,温度和离子强度有关。
为保证蛋白
质与SDS的充分结合,它们的重量比应该为1:
4或1:
3。
⑵样品缓冲液的离子强度:
因为SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS的单
体浓度,不是总浓度,而只是在低离子强度的溶液中,SDS单体才具有较高的平衡浓度。
所以SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低,常为10〜100mmol/L。
⑶二硫键是否完全被还原:
只有二硫键被彻底还原后,蛋白质分子才能被解聚,SDS才能
定量的结合到亚基上而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。
样品缓冲液中的B-巯
基乙醇的浓度通常为4%-5%,二硫苏糖醇的浓度通常为2%-3%.前者有挥发性,所以最好
在配置样品前加入。
26.配制凝胶过程中的注意事项:
*凝胶配制过程要迅速,加速剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。
注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
*水封的目的:
保持分离胶上沿平直,排气泡
*胶凝好的标志:
胶与水层之间形成清晰的界面
*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平*剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分
27.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统的选择和凝胶浓度的选择应注意什么?
缓冲系统的选择:
在被分析的蛋白质稳定的pH范围,凡不与SDS发生相互作用的缓冲液
都可以使用凝胶浓度的选择:
不同分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度
28.提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?
聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。
建议做法:
待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致
SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。
蛋白溶液中SDS过量会引起什么变化?
(1)蛋白质本身电荷被屏蔽;
(2)氢键断裂;
(3)疏水作用被取消;
(4)多肽折叠被破坏。
试列举几个影响蛋白质恢复活性的因素。
(1)SDS的纯度;
(2)蛋白酶;
(3)二硫键;
(4)蛋白的结构;
(5)辅助因子和辅酶。
为什么带出现拖尾现象?
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法:
加样前离心;
选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;
电泳缓冲液时间过长,重新配制;
降低凝胶浓度。
阴离子染料的三个缺点是什么?
(1)溶液系统中的甲醇会引起NC膜皱缩或破坏;
(2)不能用于带正电荷的膜,如尼龙膜,会使膜本身染色;
(3)灵敏度较低。
净电荷:
29.蛋白质的电泳行为:
蛋白质的净电荷是组成它的氨基酸残基的侧链基团上所有正、负电荷的总和。
等电点是蛋白质的物理化学常数,与其组成有关;
pH=pI,蛋白质的净电荷是零。
30.电泳槽与凝胶中缓冲液的成分、pH值和离子强度均不相同。
使得不连续电泳过程中有三种物理效应:
1样品的浓缩效应;
2凝胶的分子筛效应;
3一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应,使样品分离效果好,分辨率高。
31.
样品的浓缩效应
不连续体系对蛋白的分离作用
A.凝胶孔径不连续性
B.缓冲体系离子成分的不连续性
C.pH值的不连续性
D.电位梯度的不连续性
高效毛细管电泳分析法HPCE:
32.与普通电泳相比,毛细管电泳有什么优点?
使用细内径毛细管,抑制了对流和减小热扩散;
分析速度快;
分离效率很高;
可使用在线检测法;
进量少。
33..毛细管电泳有什么缺点?
制备能力差,光学检测器的光路太短,非高灵敏度的检测器难以测出样品峰;
凝胶、色谱填充管需专门的灌制设备;
大的侧面/截面积比能"
放大"
吸附作用,导致蛋白质等的分离效率下降或不出峰,同时也会影响分离的重现性。
34.高效毛细管电泳有什么特点?
仪器简单,易自动化;
分析速度快,分离效率高;
操作方便,消耗少;
应用范围极广。
35.HPCE中电渗流的流动为平流还是塞流?
塞流。
36..HPCE中影响电渗流的因素是什么?
1)电场强度的影响;
2)毛细管材料的影响;
3)电解质溶液性质的影响;
4)温度的影响;
5)添加剂的影响
37.改变电渗流方向的方法?
(1)毛细管改性表面键合阳离子基团;
(2)加电渗流反转剂,内充液中加入大量的阳离子表面活性剂,将使石英毛细管壁带正电荷,溶液表面带负电荷。
电渗流流向阳极。
38.电內渗的利弊是什么?
(1)利:
对流电泳中增加阳离子大分子的分辨率。
(2)弊:
高电内渗时阻碍大分子的迁移,耗时长。
39.HPCE中电渗流的作用是什么?
(1)可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离;
(2)改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性,如同改变LC中的流速;
(3)电渗流的微小变化影响结果的重现性。
40.HPCE中影响电渗流的因素有哪些?
(1)电场强度的影响,电渗流速度和电场强度成正比,当毛细管长度一定时,电渗流速度正比于工作电压。
(2)毛细管材料的影响,不同材料毛细管的表面电荷特性不同,产生的电渗流大小不同。
(3)电解质溶液性质的影响:
(1)溶液pH的影响;
(2)阴离子的影响。
(4)温度的影响毛细管内温度的升高,使溶液的黏度下降,电渗流增大。
温度变化来自于“焦耳热”。
(5)添加剂的影响。
41.简述毛细管电泳基本工作原理:
溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力,沿毛细管通道,以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移,并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。
42.高效毛细管电泳分析在技术上采取了哪两项重要改进?
一是采用了0.05mm内径的毛细管;
二是采用了高达数千伏的电压。
蛋白质印迹
43.叙述什么是蛋白质印迹,且简述其优势。
(1)定义:
把电泳或色谱分离的蛋白质转移到固定基质上,再对其进行进一步分析的方法。
(2)优势:
1一旦转移到固定基质上,Pr比在凝胶中容易接近探针,且几乎所有被转移的Pr都有相同的机会接触探针;
2转移到固定基质上的Pr带在探测过程中不会因扩散而失去分辨率;
3Pr转移到膜上后能进行多种分析,能得到多份结果;
4印迹法只需很少试剂(ng级),处理时间相对短,固定化膜容易操作和保存。
5蛋白质印迹法是高分辨电泳和灵敏、专一的免疫探测技术的结合!
6蛋白质印迹法中分析蛋白质时使用的探针:
7用针对蛋白质特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针;
8通常使用抗体做探针;
9抗体与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应——免疫印迹;
10免疫印迹实现了高灵敏和特异性的结合。
44.什么是电泳印记?
生物大分子物质(如核酸或蛋白质)印迹到固相载体上经封阻试剂处理后,可与相应的探针反应接着用适当的溶液漂洗,置含底物的溶液中培育,即可显出谱带。
如所用探针是放射性同位素标记物时,则应将漂洗后的载体进行放射自显影,即可检测出样品中特异的成分。
45.蛋白质印迹的应用有哪些?
分析和制备特异成分;
检测生命大分子物质之间的相互作用;
可作为诊断某些疾病的工具
46.蛋白质印迹蛋白质转移条件的选择:
离子强度:
导电性;
低离子强度。
pH:
合适的pH值使Pr远离其pI而带负电荷。
稳定性:
好,耐受高电场强度,易于转移。
蛋白质双向电泳
47.影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括哪些方面?
1待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析;
2、电泳的目的;
3、待研究蛋白的丰度;
4、样品的复杂度:
复杂度较高的样品,为了尽可能的了解所包含的每种蛋白,需要反复实验才能完成,如果将待测样品被富集以后则更易分析;
5、IPG胶条的PH范围。
48.蛋白质双向电泳中核酸对电泳有何影响,为了消除影响如何去除呢?
对电泳的影响:
增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。
解决方法:
用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解,或是利用合成载体两性电解质
(SCA)同核酸结合形成复合物的能力,再通过超速离心来去除复合物。
试
49•双向电泳分析中的样品制备其制备原则是什么?
1、应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。
2、防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
3、防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。
4、完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
5、尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。
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