细胞免疫组化Word文档下载推荐.docx

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23、中性树胶封片。

注意事项：

1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良

好细胞爬片须注意以下：

a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞

爬片才较牢固冲洗时不易脱片；

b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后

细胞连接成片冲洗时易脱片；

2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱，冰丙酮固定时

会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易

脱片）

4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜

5、TritonX-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂

质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在

胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再

做？

1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，

但是做的时候要防止脱落。

如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在

24孔，或6孔

板里做才可以。

中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看

细胞本身的荧光。

2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色

后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。

细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞

贴在玻片上爬片。

3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是

很麻烦，偶这样做很少掉片。

先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面

张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴

壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7个小时，差

不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，

到固定时细胞生长到80％左右比较合适。

偶是在盖玻片上做的，首先细胞要爬的匀一些，象dongwp

战友的就很好。

然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子

或手指把玻片从六孔板拿出来。

擦干盖玻片的背面，在玻片

背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。

细胞爬片的保存和抗原修复问题总结

1.

体浓度

细胞爬片可以用

请告知.多谢!

!

含叠氮钠

PBS

液保存

.但不知道具

0.04--0.08%。

但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行

处理，以防不必要的问题!

2.louischenwrote:

但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?

丢失

3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加

DEPC水。

其它建议用甲醇固定。

-20度保存

4.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在

4度冰箱里保存两周没问题。

时间再长就没试过了。

5.丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过

夜应该是没有问题。

不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。

如果是胞浆或胞核抗原

出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。

如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会

6.丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备

用。

7.

（1）细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟

（2）4%多聚甲醛固定，室温，20分钟

（3）70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。

2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好

8.我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好

9.细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。

10.细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定

后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置

2min

左右，弃去固定

液，不用

洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于

-70℃

长期保存。

解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰

预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达

室温时取出标本，再用PBS冲洗，在做以后的步鄹

11.我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似

的问题。

细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4

度固定15分钟，自然风干。

室温保存几周内都可以用的。

我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏

感，有的差一些。

最好避光保存在4度，同时尽量隔绝空气。

免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保

存应该是没有多大差别的。

12.细胞爬片丙酮固定后-20度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了

13.爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。

若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能

是：

1）试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。

2）加一抗前处理同石蜡切片，可进行抗原修复，如胰酶消化或热修复。

3）因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片

充分水化很重要。

建议试验前用PBS浸泡过夜。

如不能解决

你的问题请QQ联系：

81825645。

本人在湖南省肿瘤医院病

理科（长沙市）做免疫组化。

14.4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20度，2-3个月是没有问题的。

15.对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：

细胞爬片

用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，—-20

度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，

保存抗原的免疫活性好。

所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固

定剂。

当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。

1.多聚甲醛（常用4%）：

可用于免疫电镜;

也可用于

免疫荧光染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别

是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要

组织相容性抗原等

2.乙醇。

优点：

穿透性强、抗原性保存较好。

缺点：

但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较

差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;

染色过程中，温

育时间长，抗原可流失而减弱反应强度

3.甲醛（福尔马林）应用最广优点：

形态结构保存好，

且穿透性强，缺点：

甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液

pH降低，影响染色;

分子间交联形成的网格结构可能部分或

完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴

性的染色结果。

16.4度是不能保存这么长时间（1个月）的，如果抗原已

被分解，再修复也没用!

17.弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。

18.爬片置于

37度

中洗三次，每次

3到

5秒钟，

然后在

4%多聚甲醛中固定

15分钟，然后再用

37度去离子

水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。

同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续

实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

19.固定后放点PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。

20.固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。

21.四度放1周应该没问题的，你最好放在-20度，我在

-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多，不可能

一次作完，一个月没问题.

22.最佳的固定及保存方法：

（1）中性缓冲福尔马林（不必调pH）：

马林（40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和）

10.0ml

Na2HPO4.12H2o1.9653g

NaH2PO4.2H2O0.5460g

0.85%NaCl溶液溶解，定容至100ml。

（2）细胞固定：

待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖

玻片，迅速于37℃PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血

清。

（3）将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定

（4）用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，

晾干保存于-20℃备用。

可长期保存，做实验时，取出片子，

入PBS湿润后即可进行你的实验。

（H.E.）或免疫荧光。

（本帖没

有加分）

23.细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可

以用.

24.skywalkerzzwrote:

过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸

泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片?

/双氧水，你的细胞极可能是过氧化

氢导致严重脱片

25.本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。

保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。

26.细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是

倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。

27.1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固

定15min，PBS（0.01mol/l,pH7.4）洗涤3遍后是否就可以进

行免疫细胞化学染色了

2、爬片PBS（0.01mol/l,pH7.4）洗涤3遍后是否能保

存，怎样保存?

1、洗过就可以做免疫组化了。

2、固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。

做之前

再洗。

28.细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。

细胞固定后可

室温保存在丙酮中，不使之干燥。

29.如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,

30.适当密度后取出固定（丙酮-20固定10～20min），再进行免疫染色。

31.一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固

定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。

24孔板或6孔板里进行，冷丙酮

会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。

32.细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。

33.4%多聚甲醛固定后PBS水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1月。

34.如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，

凉干后再养细胞。

35.可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品

名Thermanox&

#8482;

Coverslips。

高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。

可以用剪刀任意裁剪，

使用效果好。

果比玻璃盖玻片效果好很多。

36.我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水（80%，90%，100%，100%酒精各一次，每

次10分钟左右），然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。

可以的。

免疫细胞化学染色操作规程

一、材料和

1、玻片：

须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被

处理玻片。

2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。

3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。

4、0.01MPH7.4PBS

5、1%BSA-PBS（含0.05%Tween20）

6、AEC底物

（1）底物缓冲液（20X）PH4.6

醋酸（分子量60.6）30.6ml

Triton-100

醋酸钠3H2O（分子量136.1）66.68克

加蒸馏水到960ml，调PH到4.6，最后加蒸馏水到总体积

1000ml

（2）AEC（20X）

AEC15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH（CH3）2分子量73.10中）

（3）0.6%H2O2（20X）

临用时，

（1）

（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30

分钟内有效。

7、DAB（即DAB-4HCL）

（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）

（2）1MTris（20X），用HCL调PH到7.4

（1）

（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30

溶解后（可加热到500C），加水合氯醛50克（水合氯醛

ChloralHyclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，

于棕色瓶中，室温或40C保存。

8、苏木素复染液

苏木素

1克

碘酸钠

0.2克

钾矾

50克

水

9、含

10%及

2%小牛血清的

DMEM

培养液。

10、3%H2O2：

30%H2O2

1份，加

9份双蒸水，临用时配。

11、细胞抗原玻片及

96孔细胞抗原板（见

ICCprotocol04

）

12、封片液：

1克明胶，溶于

30ml350C

水中，加入

35ml

甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。

二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用

HRP

标记二抗或

SP法

时必须阻断）

1、从冰箱取出细胞片或细胞板，

置室温或

370C10-15

分钟，

使恢复温度。

2、加3%H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分

覆盖住细胞。

3、室温10分钟后，甩掉H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。

用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保

持细胞湿润。

三、封闭

细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分钟后甩掉封闭液，

不洗。

四、免疫化学染色

1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板

50ul/孔，使充分覆盖细胞。

37℃1小时或4℃冰箱过夜；

2、弃去一抗，如为细胞涂片用

PBST轻轻简单淋洗

1次后，

浸于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）

3-5

分钟，转入第二杯

PBS（1000ml），如上法漂洗3-5

分钟。

擦

干细胞片周围水分，

96孔板则倒掉一抗后，每孔加满

PBST

在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞

湿润，反复3-4次；

3、加S.P（S.P法，即放大法）

（1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。

37℃温和孵育30分钟；

（2）按免疫化学染色&

#8220;

2&

#8221;

所述方法洗涤和擦干；

（3）加已优选好浓度的S.P，用量同&

（1）&

，

37℃孵育30分钟后按免疫化学染色&

法洗涤

及擦干；

4、间接法加二抗（不放大法）

方法同S.P法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标

记二抗。

并省略（3）步骤；

5、加底物显色

（1）、加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片

20ul/孔，板50ul/孔，置于37℃恒温箱孵育5-10分钟，一般

在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到

满意的结果（阳性对照显色程度为&

+++&

），

用自来水即可终止反应；

（2）、复染：

苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲

洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝色，最后在蒸馏

水中漂洗。

6、封片

洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油—明胶封片液，加

盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。

五、结果判

断

KSHV阳性——诱导后BCBL-1细胞有10%-30%显红

色，强度不一，未诱导BCBL-1阳性细胞（1-30%）

阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显

色（排除边缘效应）

MCMV/HVMV阳性——感染病毒的细胞有病灶反

应，显红色，强度不一，未感染细胞不显红色（排除非特异性染色）

阴性——感染细胞和未感染细胞不显

红色

注意：

1、一抗、二抗的稀释采用1%BSA/PBS，Sterptavidin-HRP

的稀释采用PBS

2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片）

3、洗涤时应使用染色缸（细胞片）六、说明

1、测血时一抗血清稀释度要求

项目

KSHV

MVMV

HCMV

其它

稀释度

1:

50，1:

100,1:

200

100，1:

500,1:

1000

可融合标准

100

阳性时

阳性

500

2、S.P法使用二抗的不同

情况

MCMV

样品母、亚上清血清、母、亚上清

血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清

一抗为IgG型，

Biotin标记二抗Biotin-AntimouseIgG

F（ab`）2,SIGMA,CAT:

B6774

一抗为IgM型，

Biotin标记二抗Biotin-Antimouse

IgGAM,ZYMED,CAT:

62-6440

稀释度1：

2003、间接法（不放大法）使用二抗的

不同情况

项目MCMVKSHV

样品血清血清、母克隆、亚克隆细胞培养

上清

HRP标记二抗HRP-AntimouseIgG

Fc,1:

100,SIGMA,CAT:

A-0168

一抗为

IgM

型，

HRP标记二抗HRP-Antimouse

POLYVALENT,1:

A-0412

1004、对照系统，必须要做的对照系统

如下：

阳性对照：

标准一抗，阳性血清，阳性上清

阴性对照：

（1）阴性一抗对照：

小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液

（2）阴性抗原细胞对照：

未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照

空白对照：

不加一抗，用1%BSA替代无关对照：

与本项目无的第一