浅论中性粒细胞趋化因子在轻重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织中的表达变化Word文档格式.docx
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【关键词】急性胰腺炎;
中性粒细胞趋化因子;
大鼠
[Abstract]Objective:
Toinvestigatetheroleofcytokineinducedneutrophilchemoattractant(CINC)inthecourseofexchangefrommildacutepancreatitis(MAP)tosevereacutepancreatitis(SAP).Methods:
Acutepancreatitismodelwasinducedbyintraperitonealinjectionofceruleinorretrogradeinfusionof5%sodiumtaurocholateintothebilipancreaticductinSDrats.SDratswererandomlydividedintofourgroups:
ceruleingroup(eighteen),salinecontrolgroup(eighteen),sodiumtaurocholategroup(twentyfour)andoperationalcontrolgroup(twentyfour).Serumamylaselevelandthehistologicalscoreofpancreasweremeasuredatdifferenttimepointineverygroup.ExpressionofpancreaticCINCproteinsandCINCmRNAweredeterminedbyimmunohistochemistryandsemiquantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR),respectively.Results:
PancreaticCINCproteinsandCINCmRNAwereincreasedinceruleingroupincomparisonwithsalinecontrolgroup6,12hoursfollowingthefirstinjection().ExpressionofCINCwascorrelatedwiththehistologicalscoreofpancreas.Nosignificantdifferencewasfoundbetweenceruleingroupandsalinecontrolgroupafter24hours.Serumamylaseandthehistologicalscoreofsodiumtaurocholategroupweresignificantlyhigherthanthoseofoperationalcontrolgroup.ExpressionofCINCproteinsandCINCmRNAinpancreaticacinarcellsinsodiumtaurocholategroup1hourafteroperationweresignificantlyhigherthanthoseofoperationalcontrolgroup.ExpressionofCINCweregraduallyupregulated(,).Conclusion:
CINCmayplayanimportantroleinthepathogenesisofAPandinthecourseofexchangefromMAPtoSAP.
[Keywords]acutepancreatitis;
cytokineinducedneutrophilchemoattractant(CINC);
rats
急性胰腺炎(acutepancreatitis,AP)是消化系统的常见疾病,尤其是重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis,SAP)可出现休克和腹膜炎等,甚至引起全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS),病情凶险,死亡率高。
中性粒细胞趋化因子(cytokineinducedneutrophilchemoattractant,CINC)作为炎症级联反应的始动因子之一,其在轻症急性胰腺炎(mildacutepancreatitis,MAP)向SAP演变过程中的作用越来越受到人们的重视。
本实验旨在模拟临床不同类型急性胰腺炎分别建立MAP和SAP大鼠模型,检测不同类型急性胰腺炎大鼠模型胰腺组织中CINC的表达变化情况,初步探讨CINC在MAP向SAP演变过程中的作用机制。
1材料与方法
材料
健康雄性SD大鼠84只,清洁级,体质量(250±
30)g,由南通大学医学院动物实验中心提供。
雨蛙肽(Cerulein)和牛磺胆酸钠为美国Sigma公司产品,兔抗大鼠GRO/CINC1抗体为美国AssayDesigns公司产品,ABC免疫试剂盒为武汉博士德公司产品,RTPCR一步法试剂盒为芬兰Finnzymes公司产品。
分组及动物模型的建立
轻症胰腺炎模型
雨蛙肽组和生理盐水组各18只大鼠,禁食12h,禁水6h后,雨蛙肽组大鼠给予腹腔注射雨蛙肽(10mg/L),剂量为20μg/kg,1次/h,连续注射5次。
生理盐水组给予腹腔注射与雨蛙肽组等量的无菌生理盐水。
分别随机选取6只大鼠在第1次注射后6,12,24h予安乐死,心脏穿刺抽取血液3~5ml,4℃3000g离心15min,离心后取血清,在-70℃中保存;
胰腺组织的胰头部分用10%中性甲醛固定24~48h,石蜡包埋;
胰体和胰尾部分立即放入-70℃中保存。
重症胰腺炎模型
牛磺胆酸钠组和手术对照组各24只大鼠,术前禁食12h,禁水6h,用2%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔内注射麻醉,腹部皮肤消毒,正中切口进腹,胆胰管近端用无损伤金属夹夹闭,向十二指肠开口方向插入注射器针头,以ml/min的速度向胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠,剂量为1ml/kg,5min后拔除注射针,松开金属夹,缝合关腹。
手术对照组仅向胆胰管注射与牛磺胆酸钠组等量的无菌生理盐水。
分别随机选取6只大鼠在术后1,3,6,12h予安乐死,标本采集同“”。
血清淀粉酶测定
采用酶法,由美国Vitros250型全自动生化分析仪测定。
大鼠胰腺组织病理评分
胰腺组织经HE染色后,由两位专业的病理医师双盲阅片,每张切片随机选取10个高倍镜视野,以水肿、感染、出血和坏死评价胰腺组织损伤的程度。
具体参考Rongione等[1]的评分标准进行病理评分,各项最低分为0分,最高分为4分,取各项积分总和为最终得分。
免疫组织化学检测大鼠胰腺组织CINC蛋白
石蜡包埋的组织标本4μm连续切片,常规脱蜡,3%的H2O2阻断内源性过氧化物酶,微波抗原修复,三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS)漂洗后,与兔抗大鼠GRO/CINC1抗体(工作浓度为1∶50)孵育,用PBS代替一抗作为空白对照,再次TBS液漂洗,用生物素化羊抗兔IgG二抗孵育,再以TBS液漂洗,并以%DABH2O2显色,最后苏木精复染及封固。
RTPCR检测大鼠胰腺组织CINCmRNA的表达
采用Trizol试剂提取胰腺组织总RNA,根据基因库中基因序列自行设计引物(序列及产物大小见表1),由上海生工生物工程公司合成。
PCR循环条件:
55℃RT反应45min;
92℃预变性2min;
92℃,30s,55℃,30s,72℃,1min;
循环40次;
72℃延伸5min,反应体系为50μl。
PCR产物在%凝胶上作电泳观察结果,用凝胶图像扫描仪测定光密度值,以GAPDH为内参照,半定量测定CINCmRNA的表达情况。
表1PCR扩增的引物序列及扩增片段的大小
统计学处理
实验数据均用x±
s表示,用Stata统计软件进行统计分析,t检验对两组均数进行显着性检验,为差异有统计学意义。
2结果
各组大鼠血清淀粉酶水平
雨蛙肽组6h血清淀粉酶明显升高,12h明显下降,24h已基本降至正常水平。
6h和12h血清淀粉酶均高于生理盐水组,差异有统计学意义(),见表2。
牛磺胆酸钠组术后1h血清淀粉酶比手术对照组明显升高,术后6h达到高峰,术后12h稍有下降。
相同时间点牛磺胆酸钠组血清淀粉酶均高于手术对照组,差异有统计学意义(),见表3。
表2雨蛙肽组和生理盐水组大鼠血清淀粉酶、胰腺病理积分和胰腺CINCmRNAn=6表3牛磺胆酸钠组和手术对照组大鼠血清淀粉酶、胰腺病理积分和胰腺CINCmRNAn=6
各组大鼠胰腺组织的形态学改变和病理评分情况
肉眼观察
雨蛙肽组6h见胰腺组织弥漫性水肿,未见出血、坏死;
12h见轻度水肿,未见出血、坏死;
24h和生理盐水组各时间点胰腺组织外观正常。
牛磺胆酸钠组术后1,3h穿刺点附近可见明显的出血、肿胀,腹腔有血性腹水,量逐渐增多;
术后6,12h除了见大量血性腹水外,胰腺质地变硬,见大片的皂化和坏死灶。
手术对照组术后1h穿刺点附近可见轻度水肿、极少量散在的出血点,无腹水,无明显皂化和坏死灶,其他时间点胰腺外观正常。
显微镜观察
雨蛙肽组6h可见胰腺组织明显小叶间水肿,少量炎性细胞浸润,未见出血和腺泡细胞坏死;
12h仅见轻度水肿;
24h和生理盐水组各时间点均偶见炎性细胞浸润,未见出血和腺泡细胞坏死。
相同时间点的雨蛙肽组病理评分高于生理盐水组,差异有统计学意义(,),且MAP大鼠早期胰腺病理评分较高,随病程延长逐渐下降。
见表2。
牛磺胆酸钠组术后1,3h可见明显小叶间水肿,片状出血,炎性细胞浸润,腺泡细胞变性坏死;
6,12h可见大量炎性细胞浸润,胰腺小叶结构破坏,大量腺泡细胞坏死。
手术对照组早期可见部分间质水肿,极少量的炎性细胞浸润,偶见点状出血,未见腺泡细胞坏死。
相同时间点的牛磺胆酸钠组病理评分明显高于手术对照组,差异有统计学意义()。
且SAP大鼠早期胰腺病理评分较高,随病程延长进一步升高。
见表3。
各组大鼠胰腺组织CINC蛋白的表达情况
雨蛙肽组6,12h部分胰腺腺泡细胞可见CINC蛋白的表达,24h和生理盐水组各时间点腺泡细胞均未见阳性CINC蛋白的表达。
手术对照组术后1,3h见少量胰腺腺泡细胞有CINC蛋白的阳性表达,表达较弱;
而术后6,12h腺泡细胞则未见阳性表达。
牛磺胆酸钠组术后1~6h有CINC蛋白阳性表达的腺泡细胞数量逐渐增多,且细胞着色逐渐加深,胰岛细胞不着色。
术后12h表达情况与术后6h相似。
各组大鼠胰腺组织CINCmRNA的表达情况
雨蛙肽组6h和12h胰腺组织CINCmRNA表达高于生理盐水组,差异有统计学意义(),见表2。
24h的表达与生理盐水组相比无差异,见图1。
牛磺胆酸钠组术后1h胰腺组织CINCmRNA表达即有升高,随时间表达逐渐升高,6h和12h达到高峰;
手术对照组CINCmRNA表达早期有轻度升高,逐渐降至正常水平,见图2。
相同时间点牛磺胆酸钠组表达高于手术对照组(,),见表3。
3讨论
趋化因子受体属G蛋白偶联的7次跨膜型受体超家族,CINC是大鼠含有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)的CXC类趋化因子中的主要成员之一,大鼠的CINC与人的生长相关基因蛋白α(GROα)有相似的氨基酸序列,提示其为与人类GROα同源的趋化因子,主要由激活的单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生,促使中性粒细胞黏附上皮细胞、迁移和组织入侵,产生氧自由基、脱颗粒等扩大炎症反应。
实验结果表明,雨蛙肽组大鼠6h血清淀粉酶水平和胰腺组织学积分最高,12h明显下降,24h已降至接近正常水平。
这种变化符合MAP是一个自限性疾病的疾病发展规律,且胰腺组织CINC的表达与其病理损害程度呈正相关,提示CINC在MAP早期大鼠的胰腺组织损害中起了一定的作用。
SAP大鼠术后血清淀粉酶水平和胰腺组织学积分逐渐升高,术后6h血清淀粉酶水平达到最高,术后12h有所下降,仍明显高于手术对照组,术后12h胰腺组织学积分较术后6h进一步升高;
免疫组织化学和RTPCR结果显示,SAP大鼠术后1~12h胰腺组织中CINC蛋白及其mRNA的表达也随着时间的推移而逐渐增强,提示CINC在SAP大鼠的胰腺组织损害中起了一定的作用,与国外的文献报道一致。
1-3:
雨蛙肽组6,12,24h;
4:
标准参照物;
5-7:
生理盐水组6,12,24h图1雨蛙肽组和生理盐水组胰腺组织CINCmRNA的表达
1-4:
手术对照组1,3,6,12h;
5:
6-9:
牛磺胆酸钠组1,3,6,12h图2牛磺胆酸钠组和手术对照组胰腺组织CINCmRNA的表达
本实验研究显示,SAP早期即有胰腺组织学损害和CINC及其mRNA的表达升高,且CINC的表达持续升高伴随有胰腺组织学损害的进一步加重。
然而,MAP和手术对照组大鼠早期也有轻度的胰腺组织学损害和CINC及其mRNA的表达升高,但仅为一过性升高,不能触发级联反应,最终并不引起多器官损害。
提示CINC的持续高表达可能在MAP向SAP演变过程中起了重要的作用。
所以我们推测很可能首先是在致病因素的作用下胰腺的腺泡细胞受损,引起局部的氧自由基、肠道细菌毒素增多、细胞钙超载等,触发腺泡细胞内的信号传导系统,通过IκB的降解磷酸化作用,使NFκB蛋白的核结合位点显露,导致NFκB快速移至核内,与多个炎症因子的启动子和增强子上的NFκB位点结合,使转录增加,引起细胞因子、趋化因子等的释放增加,导致中性粒细胞、巨噬细胞等在胰腺组织的聚集;
随后由于局部炎症介质的大量释放、局部缺血缺氧、感染和微血栓形成等因素构成“第二次打击”,促使胰腺腺泡细胞和中性粒细胞等呼吸爆发,大量的氧自由基和炎症介质释放入血液,通过血液循环到达肺组织,继发炎症细胞在肺毛细血管聚集和激活,导致急性肺损伤(acutelunginjury,ALI),甚至急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)和多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)。
针对趋化因子在AP的发生、发展中起到重要的作用,国内外学者尝试通过特异性抗体、阻断剂等方法降低血清趋化因子水平治疗AP取得了一定的疗效。
Bhatia等用绵羊抗CINC抗体干预雨蛙肽诱导的大鼠AP模型,虽然对胰腺局部的损害没有明显作用,但减轻了相关的急性肺损伤。
Yubero等用地塞米松干预大鼠AP模型,发现地塞米松可通过细胞外信号调节激酶和cJun氨基端激酶信号转导通路下调血浆CINC等趋化因子水平,同时减轻了AP的严重程度。
Bhatia等用CXC类趋化因子受体阻断剂干预AP小鼠模型,亦减轻了AP相关的肺损伤,提示抗趋化因子治疗在AP的治疗中有一定的价值。
【参考文献】
[1]RongioneAJ,KusskeAM,KwanK,etal.Interleukin10reducestheseverityofacutepancreatitisinrats[J].Gastroenterology,1997,112(3):
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BhatiaM,HegdeA.Treatmentwithantileukinate,aCXCR2chemokinereceptorantagonist,protectsmiceagainstacutepancreatitisandassociatedlunginjury[J].RegulPept,2007,138
(1):
40-48.
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