组培问题汇总及改进建议Word文件下载.docx
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3个工人洗瓶,包括掏废弃培养基、擦字、洗瓶,每个工人每天洗瓶1080个,日工资60元。
尝试包工;
购买与培养瓶配套的洗瓶机。
调动工人积极性;
减少人工成本。
5、地面净化
水泥地面,不易扫拖,有灰尘,地面长时间有水。
同培养室内部一样,铺PVC地胶。
保证环境的洁净,减少灰尘。
6、培养筐清洗
在洗培养瓶的过程中清洗
同无糖培养盒一样,进行浸泡消毒
培养筐上常有水,加之空气湿度大时,出现发霉现象。
不进行消毒处理,孢子飘散,造成空气环境污染范围扩大。
7、标记方式
记号笔书写
使用打码机。
记号笔擦字费时间,打码机标签易清理,可简化洗瓶流程。
二、配药环节
1、调pH时间
所有药品加完煮沸后测量培养基pH值,根据pH所显示数值调整pH至6.0-6.1
加入药品定容后调pH至6.0-6.1,再进行加热煮沸,并购买pH试纸条进行检测。
前期测试过,在未加热前调pH至6.1,加热煮沸后pH降低为5.3,前后pH值变化太大。
pH值作为酸碱度的参数,由溶液内氢离子浓度计算,而氢离子浓度会随温度的变化而变化,因此pH值也会随之改变。
但溶液中的物质并没有改变,本质酸碱度并没有发生变化。
现有pH计可能没有温度补偿功能,加热前后变化幅度大,最终培养基pH不准,偏碱性。
植物生长有最适pH范围,过酸或过碱都不利于生长,且培养基碱性过大时,培养基会偏硬,不利于植株对营养成分的吸收。
2、药品使用
有糖培养使用分析纯蔗糖,用量30g/L;
琼脂强度1200,用量6g/L。
用白砂糖代替蔗糖;
使用价格较低的高强度琼脂。
有糖培养中为糖类提供碳源,在各类糖源中,植株对于蔗糖的吸收最好,同样蔗糖作为植株生长的特殊信号,是其它糖类所不能替代的。
但是蔗糖价格高,在实际生产中多用白砂糖替代。
琼脂添加量与琼脂强度相关,选择高强度琼脂,可以降低使用量,综合考虑成本。
有糖培养基各成分对应成本中,糖和琼脂所占比例最大。
合适的替代品,能够降低培养基药品成本。
3、地面净化
水泥地面,不易扫拖,有灰尘。
三、灭菌环节
1、培养基灭菌时间
121℃,101KPa高温灭菌时间为20min。
增加灭菌时间为25-30min。
污染情况严重,可适当增加灭菌时间。
2、瓶盖松动
罐装灭菌后出现瓶盖松动。
检测灭完菌的培养基瓶盖松动情况,取培养基时戴手套操作。
使用匹配度高的瓶盖和瓶子,在罐装后将瓶盖拧紧。
培养基经高温高压灭菌时,内部气体会出现膨胀,瓶内气压会是瓶盖出现松动,这是灭菌时普遍存在的一种现象。
培养基从灭菌锅内取出,气压与温度降低,外部空气会立即进入瓶内,出现倒吸现象。
降低瓶盖匹配度不高,未拧紧的,这两种现象出现的频率会增加,加上环境的不洁净,出现污染的概率就会增加。
3、灭菌室空调
全天使用空调。
关掉空调,增加排风扇。
灭菌室使用空调有点奢侈,关闭空调降低费用。
4、地面净化
5、灭菌锅问题
100L灭菌锅5台,每天运行7轮,工作时间满负荷运转。
购买大型灭菌锅。
大灭菌锅灭菌效率高,操作流程简化,没有抬锅取锅的过程,单人即可操作,提高灭菌效率,降低人工成本。
四、冷凝室
1、冷凝室传递窗
并未使用。
按正常程序使用传递窗,并给配药人员、培养室管理人员配备对讲机(对讲门铃)。
传递窗同风淋门一样,为单向开门,内设有紫外杀菌装置及风机,起到杀菌作用,在使用过程中需灭菌室及冷凝室同时有人才能完成传递工作。
一直未使用,灭菌室环境洁净程度低,双向开门时空气之间存在交换,苍蝇等飞虫也会进入,会污染冷凝室环境及存放的培养基,所以需要正常使用。
人员沟通问题上,如培养室内外信号可传递,配备对讲机或声音传递设备,保证传递工作的顺利进行。
严格控制环节,减少环境的污染。
2、冷凝室空调
空调全天使用,温度设置为17℃。
升高空调温度,根据环境条件可适当关闭。
培养瓶内外温差较大,倒吸的概率增加,提高温度,降低倒吸的概率,同时节省能耗。
3、培养基放置
培养瓶用培养筐盛放,堆放于地面。
购买托盘,将培养瓶离地存放。
地面洁净程度不够,培养瓶/盒直接存放在地面,不干净。
加上组培室地面的处理,在下雨天室内湿度大,地面潮湿度更大,培养瓶外部也会出现发霉现象。
离地存放,在一定程度上保证培养基较高的洁净度。
4、无糖蛭石的准备工作
蛭石与营养液经灭菌后在冷凝室进行统一分装,只进行蛭石与营养液的混合工作。
蛭石搅拌及拨平工作由接种工自己进行。
蛭石与营养液在冷凝室混合,并将蛭石拨平后待用,接种工直接进行接种。
接种工的主要工作为接种,一切与接种无关的工作都会降低接种效率。
减少接种工拨基质的时间,留出更多时间进行接种操作,提高工作时间内的接种效率。
5、冷凝室湿度
冷凝室湿度较大白天湿度高时达到78%。
增添除湿机,降低冷凝室内湿度。
阴雨天气,室内湿度会加大,加上灭菌后的培养基、蛭石、营养液等推到冷凝室后,热蒸汽均会造成高湿环境。
高温高湿会增大培养基污染的概率。
6、环境消毒
打开接种室与冷凝室之间的门,每天进行臭氧消毒30min。
冷凝室独立放置一台臭氧机。
保证臭氧消毒的有效范围。
五、接种环节
1、接种工具
牛皮纸面积大,镊子短
适当缩小牛皮纸面积,更换稍长的镊子
牛皮纸面积大,加上超净台较小,操作过程中难免会出现手触碰到牛皮纸,手臂掠过牛皮纸上方,减少了能保证的无菌范围。
镊子较短,加上操作中个人手法问题,镊子两臂已全部进入培养瓶,有的甚至手都碰到瓶口,会增加污染的概率。
适当减少牛皮纸面积,更换稍长的镊子,能够增加无菌操作的严谨性,一定程度上降低人为因素造成的污染概率。
2、牛皮纸更换
接种无糖时,1-2瓶瓶苗更换一张牛皮纸与一套接种工具。
根据个人接种手速,速度快的2瓶更换,速度慢的,一瓶一换。
避免出现交叉感染问题,减少植株暴露在接种台上的时间。
3、酒精灯
有糖接种时,工作台内的酒精灯,一直处于点燃状态。
接种时不点酒精灯,测试污染后,减少环节。
在酒精灯火焰附近是一个无菌的环境,在实际接种时,操作区域并未在酒精灯附近,只是烤瓶口和瓶盖在其附近。
无糖接种的过程中,并未点燃酒精灯,且同时进行有糖接种,目前高污染率的情况下,检查污染过程中并未发现该类瓶苗较点燃酒精灯的瓶苗有高的污染率。
酒精灯的使用,操作稍有不慎,易造成火灾。
实际生产中,使用酒精灯的情况不是很多,在污染可控制的情况下,接种时可考虑熄灭酒精灯。
4、接种流程管理
接种工准备时间过长,接种前烤支架5min、培养基与瓶苗消毒多次喷酒精消毒。
减少接种前烤支架时间到1min,瓶苗与培养基在接种前统一喷酒精擦拭,接种过程中不再重复操作。
所有拿入超净台的东西均不能放置在地上。
准备时间过程,在保证流程的完整性下,减少准备工作所花费的时间,增加接种时间,提高接种效率。
5、接种台分类
超净台固定到人,每个工作台上的接种情况根据接种安排变化。
超净台按接种类型分类,划分区域,固定接有糖与无糖的台子。
区域式划分,可保证接种台及接种工具的相对洁净,减少交叉污染。
6、接种室消毒
每天臭氧消毒30min,表面消毒用75%酒精,拖地使用84消毒液。
每天臭氧消毒30min,地面及物体表面用医用新洁尔灭消毒。
新洁尔灭气味较小,腐蚀性弱。
7、接种计件
按小时计算工资,接种量无法保证,积极性不高。
计件,瓦解现有工人内部的“团结性”,拉大工资差距,各个击破。
增加工人积极性,提高接种速度,增加生产量。
六、有糖培养
1、瓶苗质量
细菌污染严重,一直在重复使用,植株生理异常情况的出现,均可能与细菌污染有关。
购买吴有光老师的抑菌剂,解决细菌污染问题,逐步淘汰更换质量差的瓶苗,调整植株状态。
或考虑购买优质瓶苗。
原因:
原则上出现污染的瓶苗一律都不能再使用。
目前除真菌污染外,大部分都带有细菌极少数为干净瓶苗。
使用抑菌剂,希望能到挽救一些瓶苗,降低细菌污染的比率。
目前新建外植体已错过时间,考虑购买优质瓶苗,不影响明年生产。
2、外植体
新建外植体部分带细菌。
抑菌剂调整污染外植体,保留干净健壮外植体,尽早淘汰带菌、异常。
外植体是后期增殖与生根的基础,是生产优质种苗的前提,必须严格挑选,淘汰所有问题苗,保留优质资源用于生产。
3、配方
现有配方增殖系数不高,分化苗不壮,壮苗分化差,株高不达标,不是最优的生长配方。
调整现有瓶苗质量,挑选质量好的做激素配方的浓度梯度实验,转接2轮后,观察生长情况。
合适的配方才能有效得控制植株的生长状态达到预期效果,需要根据植株体内激素水平的变化进行调整。
频繁变化激素,瓶苗状态不稳定,实验结果可靠性差,至少2轮稳定激素水平后,测试实验效果。
现有配方也是经过实验得出的,但是效果不好,所以必须跳出原有的思维限制,放大激素范围,普筛激素配比,才可能出现适宜的稳定性配方。
4、灯光
瓶苗整体质量差,灯光作为环境因子,对生长有影响,但在目前情况下,暂不考虑光的影响。
整体瓶苗质量改善后,可尝试灯光实验。
5、壮苗
将瓶苗状态不好,未达到进无糖标准的植株接种再次接种至培养基中进行复壮后,接进无糖培养。
去掉壮苗环节。
壮苗环节是繁育流程中多余的一步,增加了培养时间,拖慢了整个生产进程,继代苗进无糖才是常规环节。
植株体内激素水平的积累最好维持相对稳定,才能测试出最适的配方。
七、无糖培养
1、蛭石
使用3-6mm的大颗粒蛭石。
进行不同规格蛭石测试,选择小颗粒蛭石,综合考虑生根和成本问题。
无糖培养的使用多孔性无机材料代替琼脂作为支撑物,蛭石的使用,能够增加基部透气性,利于生根,相比琼脂价格降低很多。
蛭石颗粒大,透气性会增加,但不同植株对于根部透气程度的适应性不同,比如马铃薯无糖培养使用的是最小规格的蛭石。
大颗粒蛭石质量好,不一定适合苹果苗的生根。
小颗粒蛭石也可能更适合苹果苗生根,同时价格低,可降低生产成本。
2、瓶苗标准
要求5片以上大叶,株高2cm以上植株进无糖,但实际接种过程中,达标植株占比少,并未严格按照标准进行接种。
株高达标,下部茎杆留长,除去基部少量叶片,接种至无糖,插入深度在0.5cm以上,基质上部留5片以上叶子,生长点不埋进基质内。
无茎杆,插入深度不够,无法吸收到营养液,前期湿度低,易出现干枯,2周左右叶片发红,无法生根。
无糖生根是组培室内部种苗繁育的最后一部,把控不严,生根率低,前期的工作相当于全废。
3、无糖接种准备
蛭石与营养液的添加由管理人员进行,目测基质添加量,每盒加入1L营养液。
混合后基质湿度不够后,在添加适量营养液。
由专人负责蛭石与营养液的添加,定量操作形成标准,完成混装、拨平、喷抑菌剂等准备工作。
添加不定量,会出现基质营养过少或过剩问题。
由专人负责,按标准定量,保证每盒基质营养的均一度,减少接种工其它工作时间。
4、抑菌剂
营养液中加入抑菌剂,与蛭石进行混合,使用浓度为0.67g/L.
按浓度配置好抑菌剂,基质与营养液混合拨平后,在基质与盒盖表面用喷壶喷抑菌剂;
完成接种后,在叶片表面喷抑菌剂。
无糖污染多为真菌污染,且多因空气环境影响,在基质与叶片表面喷施抑菌剂,可起到抑菌作用,同时降低抑菌剂的使用量,减少成本。
5、培养室湿度
接种后前三天,保持湿度在95%以上,3-7天内湿度保持在90%以上,7-10天内保持适度在85%以上,10天后湿度保持在75%以上。
培养室湿度控制在70%左右。
加湿器湿度过高,会缩短灯管和气泵使用寿命。
6、保鲜膜覆盖
接种完后,会用宽的保鲜膜覆盖透气孔,系保鲜膜缠住穿板接口。
去掉该环节,无糖接种完成后,直接拿入无糖培养室,并连接气管与穿板接口。
该步骤主要作用为保湿,加大培养室湿度后,完全没有必要。
去掉保鲜膜,对生长无影响。
7、二氧化碳浓度
通小气时二氧化碳浓度为800-1300ppm,通大气时二氧化碳浓度为1300-1800ppm。
二氧化碳浓度保持在800-1200ppm。
简化过程,减少二氧化碳使用量。
8、初始通气时间
常规为7天,根据植株长势,测试一部分提早通气,为第5天开始通气。
7天通气。
生产上统一时间标准,不考虑植株长势状态,7天较为适宜。
9、生根激素
经实验后,目前生产所用激素为0.6mg/LIBA。
尝试IBA与IAA组合。
尝试。
10、灯光
白光多、红白配比。
开灯时间分四阶段,黑暗、2盏、3盏、4盏。
可尝试光质配比实验。
开灯时间改为黑暗、2盏、4盏。
白光为全光谱,普遍适应性较强,不同植物对光质的响应不同,可尝试最佳光配比。
减少管理上的操作。
八、炼苗
1、基础设施
露天大棚,遮阳网覆盖、棚内为泥地。
增添防雨设施,地面铺砖。
大棚简陋,环境不可控,仅能遮荫外,同大田一样,下雨无法进行工作,棚内湿度大,雨后杂草疯长,地面泥泞无法进入。
增添防雨设施,保证下雨也可正常工作,一定程度上控制了棚内湿度。
2、炼苗基质
1袋草炭(300L)+1袋珍珠岩(75L)+蛭石30L(无糖使用)
适当加大蛭石使用量。
松散、透气、保水的无机材料,携带病菌及虫卵的概率也低。
具体配比需测试。
九、脱毒
自建外植体、剥离茎尖、没有进行脱毒处理
联系西农进行脱毒,购买脱毒材料进行扩繁生产。
脱毒是组培的优势,植株长势、抗性、产量都会提高。
生产上虽做不到完全脱毒,检测管理机构也不完善,但是脱毒是组培生产的第一步。
在技术上有缺失的情况下,联系西农老师进行脱毒,购买脱毒苗可满足生产需求。
但从长远角度考虑,脱毒技术是组培的关键,是扩大组培品类的基础技术,购买脱毒苗不是长久方法,先进脱毒技术,是公司发展的核心技术,也是必须要掌握的。
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