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数字包的概念年1999Vogelstein等提出了数字PCR(digtalPCR,dPCR)
扩增和荧光信号分析。
先将是样品稀释后分配到大量微小的PCR括两部分,即
然后分别对目反应单元中,每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子
PCR
标分子进行扩增,扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。
数字
有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子,采用直接计数的方法进行定量分析,,理论上,在样品中极限稀释的情况下,有荧光信号的反应单,无荧光信号的则即为0记为1但是有的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分元数目等于目标DNA分子的拷贝数。
[8]不受这时需要用泊松概率分布公式进行计算子,。
不同于传统的,技术数字PCRqPCR
(CT)和扩扩增曲线的循环阈值
[9]
。
增效率的影响,无需参照,准确性和重复性好,可实现绝对定量分析
、微流控芯片和微:
孔板数字微反应室/PCR分为三类PCR根据反应单元类型不同,数字,PCR滴数字系统。
微反应室PCR孔板数字借助高通量自动上样设备和增加的反应单元数/
实现快速精确取样,提高检测灵敏度。
微流控芯片技术是
低成本分析。
微平台,可实现高通量、dPCR一种基于含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片的
是将含有目标分子的样品分成成千上万个纳升级,ddPCR)R(dropletdigitalPCRPC滴数字再对每个微滴进行扩增,的油包水微滴,和荧光信号的采---
[10]。
集,更容易实现小体积和高通量
但其也存在一定缺点,数字PCR可绝对定量,是目前灵敏度最高的检测技术,
如生成的微滴必须服从泊松分布,所以不适合高浓度DNA样本检测,;
只能检
[11,12]。
测已知的突变且一次只能检测一种突变
2.BEAMing技术
以它是结合了数字技术在检测ctDNA内体肿瘤突变具有非常高的灵敏度,PCRBEAMing
及流式技术的一种检测方法,最早是由BertVogelstein提出。
其方法
DNA分子之间的差异可分子都会专一的与磁性珠相连接,然后是每一类DNA
(Bead)以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。
这种方法是基于小珠、乳浊
,这四个主要组分来构建的,所(Magnetic)(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性液
[13]。
以被称作为BEAMing
;
接着是预扩增步骤,通过使BEAMing技术的过程包括:
DNA首先是分离和纯化血浆中的模板再通扩增目的基因片段,使用引物与已知的标记序列混合;
然后,这些DNAPCR用常规扩增,应用引物探测这些序列,通过链酶亲和素磁珠相互作用与有磁性的微胶珠结PCR过乳液产物将保持对通过这种方式设计的系统,在反应结束之前,每个乳液液滴中生成的PCR合。
[14]技术是利BEAMing。
并且,微胶珠的附着性,使其可以很容易地通过磁性进行分离和纯化
DNA用磁珠来吸附游离,它可以从1万个健康细胞分子,DNA中检测出那一个ctDNA
ctDNA
具有较高的敏感性,同时在很多研究中其在肿瘤组织中发现的突变都和
[15,16]。
部分突变是一致的
BEAMing技术相比其他检测技术具有很多优势:
(一)在常规实验室条件下,
(二)特异的突变可以通分子可以通过该种方法来进行评估。
DNA数以万计的
过流式细胞仪进行分离筛选以备进一步分析和研究。
技术可以用BEAMing(三)
来对特定组织或者人群中罕见的突变,以及研究一般基因序列或转录的产物的变
拷贝的数量是很低的,特别是相ctDNA异都可以提供相应的鉴别和定量分析。
由于外周血流中过程中的一个重PCR使用DNA较于野生型来说。
出于这个原因,进行扩增是DNABEAMing
[17]
要部分,是确保可靠检测的保证。
[5]
操作也较复杂,通量低,且单分子扩增在非均一的微滴中实现,需要RCR预扩
---
[12]。
增,会增加试验误差
技术的检测方法3.基于NGS
检测方法之外,还有一种以高通量测序技术,ctDNA检测技术,除了基于PCR
)为基础的检测方法。
这种方法主要是选定十几到“下一代”测序技术(NGS又称
几十个肿瘤相关基因进行测序,测序通量和效率高。
NGS根据富集策略的不同,基于的技术目前又可分为靶向扩增子测序(TAS)
。
及目标序列捕获测序(TCS)
PCR引物,靶向扩增子测序(TAS)技术是针对目的基因设计几十对甚至上百对
(TAM-Seq)。
Forshew
利用多重PCR扩增富集。
代表性方法有标记扩增深度测序
等[18]通过TAM-Seq测序技术,检测患者癌细胞中ctDNA片段,从而找到肿瘤
样品中的遗传突变。
这种方法无需外科手术或者活检,就可以找到癌症突变。
目标序列捕获测序(TCS)技术是针对目的基因设计探针,通过捕获杂交的方法
[19]
407
从肿瘤基因突变数据库找复发突变相关的外显子,再从肿瘤基因图谱库的
然后应用迭代算法使每个非小细胞位非小细胞肺癌患者全基因组测序结果筛选。
selector能识别的大小,最后的肺癌患者样本的错义突变最大化来简化筛选器(selector)个个复发突变基因中的521个外显子和,平均能够识别4125kb12个内含子,长度约为139
),在单核苷酸突变(SNV96%的肺腺癌或鳞癌患者身上有效。
NGS技术的检测方法灵敏度高,能同时检测多个基因的多种变异。
但是基于
其技术复杂,数据处理困难,实验室水平差异较大,仪器与试剂的成本相对较高。
[12]
4.ARMS技术
ARMS,全称为突变扩增系统(Amplificationrefractorymutationsystem),是由
[20]。
利用PCR引物3'
端碱Newton等人首先建立并用于检测基因已知突变的方法
DNA互补才能进行有效扩增的基本原理,根据已知突变位点设基必须与其模板
”“突变实现扩增,达到将'
末端碱基分别与突变和野生型模板碱基进行互补,计引物,使3
[12]“野生模板与”模板区分的目的。
成本低,操作简单等特点。
其检高灵敏度以及耗时短,法的主要特点有高特异性,ARMS
测结果的高特异性关键在于引物设计。
ARMS法所用的引物是通过筛---
选能够识别单个位点等位基因的引物,进而保证了结果的高特异性。
而ARMS
DNA错配PCR法检测点突变的检出率还取决于反应条件的优化和防止引物与靶
酶浓浓度、Taq可能发生的错配延伸。
PCR反应条件的优化可以通过改变引物浓度、靶DNA
[21]度以及反应体系温度进行调整。
此外,在反应体系中加入甲酰胺
可以减少非特异性扩增,在引物3'
末端引入第二个错配碱基也可以提高引物的特
[21]。
通过在体系中加入多对引物可以实现多重扩增,实现基因的多位点突异性
[22]变检测。
可检测出样品中含量低法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法,ARMS
技术,操作简单,耗时短,成本低,结果直观PCR0.1%~1.0%的突变基因;
且该方法结合至[23]。
目前,ARMS法已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一,其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。
但该方法只能用于检测已知突变,在一定程度上限制其应用。
ARMS法检测可以分为实时荧光定量PCR和巢式ARMS法电泳检测。
实时荧
光定量PCR是指ARMS技术结合探针对扩增产物进行检测,在实时定量PCR平台上实现对样[24]。
而巢式ARMSDNA品中稀有突变的检测法电泳检测是利用凝胶电泳技术检测扩增带,从[25]。
而实现结果分析
试剂盒相继问世,包括人表皮生长因子受体ARMS技术的发展,商品化的随着ARMS
基因突变检测试剂盒,四项耳聋基因检测试剂盒等(EGFR)基因突变检测试剂盒,人KARS
[13]。
总结
作为重要的肿瘤分子标志物,ctDNA在肿瘤的诊断、治疗监测、预后等方面发挥着重要的作用,而DNA测序技术的发展使得通过检测ctDNA来指导肿瘤的临床进展变得更加切实可行。
PCR技术、BEAMing技术、NGS技术、ARMS技术在ctDNA的检测中各具其独特的优势和不足之处,实际应用时应结合具体
条件决定采用何种检测方法。
相信随着技术的进步,ctDNA将会逐渐从科研领域向临床转化发展。
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