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②.化学法
③.定点突变方法。
三.别构酶结构及活性调节:
四.与基因表达调控有关的酶活性表达的其它因素
五.酶的结构改变对其催化功能的影响
(一)酶的一级结构改变对其催化功能的影响
1.主链断裂
2.二硫键断裂
(二)酶的二、三级结构改变对其催化功能的影响
(三)酶的四级结构破坏对其催化功能的影响
第五节酶的作用机制┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈4学时
一.酶和底物结合的作用力
二.酶促反应的中间产物学说及酶的高效性*
1.中间产物学说:
2.高效性
3.酶与底物的结合方式
三.酶的作用机制
(一)趋近与定向效应
(二)构象变化效应
(三)多元催化:
1.酸碱催化
2.共价催化
3.金属离子催化
(四)微环境效应
四.辅因子在酶促反应中的作用
(一)金属离子在酶促反应中的作用
1.分类:
2.作用:
(二)有机辅助因子在酶促反应中的作用
第六节
酶催化反应动力学┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈3学时
一.单底物反应动力学
(一)底物浓度对酶反应速度的影响
(二)米氏方程的推导*
1.前提
2.米氏方程的讨论
①Km的意义:
②对Km的分析
③Km的应用*
a.鉴定酶:
b.判断酶的最适底物:
c.判断酶的专一性以及研究酶的活性中心:
d.判断不同来源的同一种酶催化同一底物的反应是否存在有差别:
e.计算一定速度下的底物浓度或一定底物浓度下的反应速度。
f.了解酶的底物在体内具有的浓度水平:
g.判断催化可逆反应酶的反应方向或趋势:
h.推测具有几种代谢途径的物质在特定生理条件下的代谢途径:
i.判断可逆抑制作用的抑制类型。
④两组概念的区别:
*
a.Km与Ks
b.Km与Km/
⑤反应速度v0与底物浓度[S0]之间的关系
⑥反应速度v0与酶浓度[E0]之间的关系
⑦酶的转换数Kcat
3.米氏方程中Km及Vmax的求法*
4.酶促反应的稳态前动力学
二.抑制作用动力学
(一)抑制作用及其类型:
1.抑制作用:
2.类型:
3.区别可逆与不可逆抑制作用的动力学方法:
(二)不可逆抑制作用
1.非专一性不可逆抑制剂:
2.专一性不可逆抑制剂:
①Ks型不可逆抑制剂
⑴结构特征:
⑵作用特点:
⑶应用:
②Kcat型不可逆抑制剂
(三)可逆抑制作用*
1.竞争性抑制
①竞争性抑制剂结构
②抑制原因
③抑制效果
④动力学:
a.米氏方程与双倒数方程:
b.米氏方程图
c.双倒数作图
⑥Ki的确定
2.非竞争性抑制
①抑制剂结构
a.米氏方程:
b.米氏方程曲线
c.双倒数作图
③Ki的确定:
3.反竞争性抑制
①抑制作用特点:
②I不与底物分子竞争酶分子上的结合位点,故抑制作用不能通过增加底物浓度来消除;
③动力学:
b.米氏方程曲线
④Ki的确定:
4.混合型抑制
5.部分抑制:
6.底物抑制
7.产物抑制:
三.多底物反应动力学
1.酶促反应按底物数分类(表1)
2.Cleland命名和表示法:
3.双底物双产物反应动力学分类
(1)反应过程中形成三元络合物
a.序列有序机制
b.序列随机机制
(2)反应过程中要形成三元络合物—乒乓机制
第七节别构酶及其反应动力学┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈6学时
一.概念:
二.分类:
1.根据别构效应物(调节物)的不同
2.根据协同效应效果:
三.结构特点:
四.动力学特征:
*
(一)米氏作图
(二)双倒数作图
五.别构效应类型的判断:
(1)动力学作图法:
(2)协同指数:
(3)Hill系数:
(4)Scatchard作图
六.别构效应的动力学模型:
(一)MWC模型(齐变模型,同构模型)
1.主要观点:
2.特点:
(二)KNF模型(序变模型)
七.别构酶的生理调节功能:
1.正协同效应
2.负协同效应
第八节pH和温度对酶催化反应速度的影响┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.pH值对酶促反应的影响
1.影响方式:
2.最适pH:
3.pH对酶稳定性的影响:
4.影响机制:
(双解离模型)*
二.温度对酶催化反应的影响
2.最适温度:
3.衡量温度对酶促反应影响的两个物理量:
①临界失活温度:
②Q10:
第二章
酶的发酵生产
第一节概述┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.酶的发酵生产:
二.优良的产酶细胞应具备的条件
1.酶的产量高;
2.容易培养和管理;
3.产酶稳定性好;
4.利于酶的分离纯化;
5.安全可靠。
三.酶的发酵生产类型
(一)固体培养发酵(传统方法)
(二)液体深层发酵:
①适用性强,可用于各种细胞的悬浮培养和发酵;
②易于人为控制;
③机械化程度高,酶产品质量较好,酶产率及产品回收率较高。
(三)固定化细胞发酵(70年代后期)
1.优点:
2.缺点:
(四)固定化原生质体发酵(80年代中期)
第二节发酵工艺条件及控制┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈3学时
一.产酶细胞的保藏:
(低温)
二.细胞活化与扩大培养
1.细胞活化:
2.扩大培养(制备种子液)
三.培养基的配制
(一)碳源:
1.选择原则:
①营养;
②对酶生物合成的调节作用:
③原料的供求和价格。
2.酶发酵生产中常用的碳源:
(二)氮源:
1.来源
2.选择原则:
①根据不同的细胞要求选择
②注意C/N比
(三)无机盐
1.作用:
2.分类
3.添加方式:
(四)生长因素:
四.pH值的调节
(一)pH对细胞生长繁殖及发酵产酶的影响:
(二)控制与调节措施
五.温度的调节控制
1.温度对酶的发酵生产的影响:
2.调节控制
六.溶解氧的控制
(一)细胞只能利用溶解氧,调节溶氧速率的措施:
1.调节通气量;
2.调节氧分压;
3.调节气液接触时间;
4.调节气液接触面积;
5.培养基的特性对溶氧速率有明显影响。
(二)溶氧速率不宜过高,这是因为:
七.提高酶产量的其它措施
1.添加诱导物
2.控制阻遏物浓度
3.添加表面活性剂
4.添加产酶促进剂
第三节产酶动力学┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.酶生物合成的模式
(一)细胞生长曲线
(二)酶生物合成的模式
1.同步合成型
2.延续合成型:
3.中期合成型:
4.滞后合成型:
(二)影响酶生物合成的主要因素:
(三)延续合成型是酶的工业生产中最理想的合成模式。
二.细胞生长动力学(Monod方程)
三.产酶动力学
第四节微生物细胞发酵产酶┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.菌种的分离纯化:
二.富集培养:
三.菌种纯化:
四.菌种变异:
1.物理或化学方法诱变:
2.基因工程方法:
五.酶的生产:
第六节酶制剂的工业制备法┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.发酵液的预处理
二.发酵液的分离、过滤:
三.酶液的脱色
四.发酵液的浓缩与初步提纯
五.精制
六.浓缩与干燥
第三章酶的分离工程
第一节酶分离纯化的一般原则┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
第二节细胞的破碎及酶的提取┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈2学时
一.生物材料的破碎
(一)机械破碎法
(二)物理破碎法
1.温度差破碎法:
2.压力差破碎法:
3.超声波法:
(三)化学破碎法
(四)酶促破碎法
二.酶液的提取*
1.典型的提取液的组成
2.提取液各组分的作用:
(1)离子强度调节剂与缓冲剂:
(2)温度调节剂:
(3)蛋白酶抑制剂:
(4)抗氧化剂:
(5)重金属螯合剂:
(6)增溶剂(去垢剂):
使膜蛋白溶解。
①结构:
②特性:
③分类:
a.离子型去垢剂:
b.非离子型去垢剂:
c.两性去垢剂:
3.酶的提取方法
(1)盐溶液提取(盐溶)
(2)酸溶液提取
(3)碱溶液提取
(4)有机溶剂提取:
第三节
酶的纯化┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈3学时
一.调节溶解度*
(一)改变离子强度
1.盐溶与盐析
2.盐析用盐:
3.常用的盐:
(二)改变pH值(等电点沉淀法)
(三)改变温度
(四)有机溶剂沉淀法
1.沉淀机理
2.常用有机溶剂:
3.特点:
4.缺点:
(五)复合沉淀法
1.概念;
2.常用的复合沉淀剂:
3.PEG沉淀
二.根据酶分子大小、形状不同的分离方法
(一)离心分离:
1.技术参数:
2.常用离心技术
①差速离心
②速率区带离心
③等密度梯度离心
(二)凝胶过滤:
1.原理:
2.应用时的注意事项
(三)过滤与膜分离
1.过滤:
①概念:
②过滤介质:
根据过滤介质截流的物质颗粒大小的不同
(二)膜分离技术
②介质:
a.扩散膜分离:
b.加压膜分离:
c.电场膜分离:
三.根据酶分子电荷性质的方法*
(一)离子交换层析:
2.离子交换剂:
3.原理:
(二)电泳
2.分离原理:
3.介质:
(三)等电聚焦
2.等电聚焦用缓冲液:
3.分离过程:
四.根据专一性结合的方法*
(一)亲和层析
1.概念
2.原理
3.亲和配体:
4.配基(固定相):
(二)吸附层析
2.吸附剂:
3.吸附与洗脱:
(三)共价层析
2.原理:
五.萃取分离
2.传统的液液两相系统含有有机溶剂,易使生物大分子变性失活,所以在生物大分子分离中受到限制。
3.对传统萃取分离方法的改进:
①双水相系统萃取法:
②双水相亲和萃取:
③超临界萃取:
1)概念:
2)超临界流体:
3)分离:
六.酶的结晶
1.条件
2.方法:
①盐析结晶:
②有机溶剂结晶:
③透析平衡结晶:
④等电点结晶:
⑤温度差法结晶:
⑥金属离子复合结晶法:
第五节浓缩与干燥┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.浓缩:
3.廉价而实用的浓缩方法—蒸发浓缩
二.干燥:
2.目的:
3.方法:
①真空干燥:
②冷冻干燥:
③喷雾干燥:
④气流干燥:
⑤吸附干燥:
第三章酶与细胞固定化
第一节酶的固定化┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈2学时
一.固定化酶(immobilizedenzyme)的定义
二.固定化酶的优缺点
(一)优点
(二)缺点
三.固定化酶的制备原则
四.酶的固定化方法分类及主要特点
五.固定化酶的性质
1.稳定性:
2.最适温度:
3.最适pH值:
a.载体性质对最适pH的影响:
b.产物性质对最适pH的影响:
4.底物特异性:
5.酶活力:
6.米氏常数:
第二节辅酶的固定化┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
第三节细胞的固定化┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.概述
1.固定化细胞的研究和应用始于20世纪70年代。
2.固定化细胞较固定化酶的优越性:
3.缺陷:
二.固定化细胞的分类
1.固定化死细胞:
2.固定化静止细胞与饥饿细胞:
3.固定化增殖细胞:
三.固定化细胞的制备
1.吸附法。
2.包埋法。
四.固定化细胞技术今后发展的重要方向—基因工程菌的固定
1.提高基因工程细胞的稳定性;
2.目的基因产物的产量提高;
3.保持宿主中的质粒稳定性和拷贝数。
第四节原生质体的固定化┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈┈1学时
一.固定化细胞在实际应用中的缺陷
二.固定化原生质体的制备
(一)原生质体的制备
1.方法:
2.酶解条件:
①对数生长期细胞;
②渗透压稳定剂:
③其它条件如温度,pH值,离子强度及作用时间等根据酶的类型。
3.制备的一般过程:
(二)原生质体固定化:
第五章酶的化学修饰(分子工程)
一.酶化学修饰的目的*
二.酶化学修饰的分类
三.定向进化概念,理性设计和非理性设计,半理性设计
第六章酶的非水相催化
分水相分类
非水相反应体系
水活度
pH记忆
第七章酶的非水相催化
反应器种类及特点
反应器选择依据
思考题:
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