胰蛋白酶分离纯化与动力学研究文档格式.docx
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trypsin;
eggprotein;
affinitychromatography;
-Mentenconstant;
enzymaticreactionforce;
Polyacrylamidegelelectrophoresis
1前言
1.1研究背景
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
是当代生物产业当中的核心技术。
该技术难度、成本均高。
[1]
蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中(包括催化代谢反应、物质运转、兴奋的传导、生长发育的控制等)起着重要的作用,因此,蛋白质是生命科学极为重要的研究对象。
蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中不可缺少的环节,只有了解蛋白质的分子量、溶解性、等电点以及稳定性等基本性质,才能达到有效分离。
[2]
酶促反应动力学(kineticsenzyme-catalyzedreactions)主要研究各种理化因素对酶促反应速度的影响。
在酶的结构与功能关系以及酶作用机理的研究中,需要动力学研究提供实验证据。
为了最大限度地实现酶促反应的高效率、寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机理等,都需要掌握酶促反应速度的规律。
因此,酶促反应动力学是酶学研究中的一个既具有重要理论意又具有实践意义的课题。
影响酶促反应速度的因素主要有底物的浓度、酶的浓度、温度、pH值、酶的激活剂及抑制剂等。
1.2胰蛋白酶简要介绍
胰蛋白酶Trypsin(Parenzyme)为蛋白酶的一种,EC3.4.4.4,是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。
在脊椎动物中,作为消化酶而起作用。
在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。
作为胰液的成分而分泌,受肠激酶,或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶,是肽链内切酶,它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。
它不仅起消化酶的作用,而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体,起活化作用。
是特异性最强的蛋白酶,在决定蛋白质的氨基酸排列中,它成为不可缺少的工具[1]
1.3蛋白分离纯化方法综述
1.3.1沉淀法
沉淀法也称溶解度法。
其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质,进而导致有效成分的溶解度发生变化。
1.3.1.1盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随盐浓度的增高而上升,但当盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。
1.3.1.2有机溶剂沉淀法
有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二:
其一、与盐溶液一样具有脱水作用;
其二、有机溶剂的介电常数比水小,导致溶剂的极性减小。
1.3.1.3蛋白质沉淀剂
蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用,常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。
1.3.1.4聚乙二醇沉淀作用
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
1.3.1.5选择性沉淀法
根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点,用适当的选择性沉淀法,即可使杂蛋白变性沉淀,而欲分离的有效成分则存在于溶液中,从而达到纯化有效成分的目的。
1.3.2吸附层析
1.3.2.1吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
1.3.2.2薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层。
1.3.2.3聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的。
1.3.3离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
1.3.4凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析,其原因是凝胶具有网状结构,小分子物质能进入其内部,而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
1.3.5亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似,每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中,特异的底物(S)才能和一定的酶(E)结合,产生复合物(E-S)一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,并产生复合物。
而亲和层析与酶-底物反应不同的是,前者进行反应时,配体(类似底物)是固相存在;
后者进行反应时,底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上,制成亲和吸附剂M-L,或者叫做固相载体。
而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。
因此,当把固相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后,让欲分离的样品液通过该柱。
这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了第一个层析峰。
然后,恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子,即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第M个层析峰。
显然,通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开。
用过的固相载体经再生处理后,可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。
除此之外,还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。
这两种亲和层析法相比,前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。
而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料,以及氨基酸等),它成本低廉、具有较高的吸附容量,通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
1.3.6聚焦层析
聚焦层析也是一种柱层析。
因此,它和另外的层析一样,照例具有流动相,其流动相为多缓冲剂,固定相为多缓冲交换剂。
聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。
1.3.7气相色谱
多种组分的混合样品进入色谱仪的气化室气化后呈气态。
当载气流入时,气化的物质被带人色谱柱内,在固定相和流动相中不断地进行分配.在理想状态下,溶质于气-液两相间的分配可用分配系数Kg描述。
当分配系数小时,溶质在柱中就停留时间短,也即滞留因子(Rf)大,所以它将首先从色谱柱流出而进入鉴定器,经放大系统放大后,输出讯号便在记录仪中自动记录下来,这时呈现的图形为色谱图,亦称色谱峰;
当分配系数大时,溶质在柱中停留时间就长,其色谱图在记录仪上后出现。
由于不同物质有不同的分配系数,所以将一混合样品通过气-液色谱柱时,其所含组分就可得到分离。
气相色谱柱效率高、分辨率强的重要原因是,理论塔板数(N)大。
毛细管气相色谱的N可达105~6。
增加理论塔板数和降低样品组分的不同分子在展层中扩展程度(速率理论),就可明显地提高柱效。
1.3.8高效液相色谱
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统,下面将分别叙述其各自的组成与特点。
1.4胰蛋白酶研究进展
胰蛋白酶为蛋白质水解酶,能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链,能消化溶解变性蛋质,对未变性的蛋白质无作用,因此,能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀,易于引流排除,加速创面净化,促进肉芽组织新生,此外还有抗炎症作用。
临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。
喷雾吸入,用于呼吸道疾病。
也可用于治疗毒蛇咬伤。
还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
胰蛋白酶不仅是一种重要的消化酶,而且对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶前体的活性化等其重要作用。
胰蛋白酶也是一种重要的工具酶,特别在生物化学、蛋白质组学、细胞生物学、医学等领域中得到了广泛的应用,利用胰蛋白酶可将大分子蛋白质酶解成小分子多肽片段以用于质朴分析、动物细胞培养、制备人胰岛素等。
蛋白质间的专一性吸引力,已成为最近生物化学探讨的重要主题。
2实验原理
2.1胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与定量
2.1.1蛋白质沉淀
蛋白质变性后,疏水侧链暴露在外,肽链融汇相互缠绕继而聚集,从溶液中析出沉淀。
变性的蛋白质易于沉淀,但沉淀的蛋白质不一定变性(如盐析法沉淀)。
2.1.1.1盐析
在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐(如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等),破坏蛋白质的胶体稳定性(蛋白质脱去水化膜),使蛋白质从水溶液中沉淀。
盐析法不引起蛋白质变性,只需经透析除去盐分,即可得到较纯的保持原活性的蛋白质。
2.1.2蛋白质定量
蛋白质定量是最基本的生化操作,方法很多,但其原理都还是基于蛋白质分子的基本构造。
早先使用Biuretmethod,是根据蛋白质骨架与铜离子结合,利用所产生的还原力显色;
而Lowrymethod是以Biuretmethod为基础,再加上蛋白质中Trp侧基的显色,使得分析更为灵敏。
最近则使用染料CoomassieBrilliantBlueG-250(CBG);
当蛋白质与CBG结合之后,CBG由茶色变成蓝色,显色浓淡与蛋白质量成正比,称为Bradfordmethod。
2.2亲和层析法分离纯化胰蛋白酶
配体
Ligand(A)
2.2.1亲和层析法的各项要素
B
(3)偶联反应
CouplingReaction
(2)
SolidMatrix
(4)溶离
Elution
(1)专一性结合
SpecificBindingSubstance(B)
图亲和层析法的各项要素
2.2.2亲和层析法介绍
图亲和层析法的作用机理
A+B=AB,Kd=约在10-4至10-8
式
2.2.3胰蛋白酶活性测定
在动物胰脏中,胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下,胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后,在小肠上腔有Ca2+的环境中,为肠激酶或胰蛋白酶所激活,其肽链N-端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解,失去一个酸性6肽,其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24,000,其等电点为pH8.9;
胰蛋白酶的分子量约为23,400,其等电点为pH10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定,其浓溶液可贮存于冰箱(0℃以下)数周而活性无显著丧失。
pH<3时,胰蛋白酶易变性。
pH>5时,胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6~7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解,对于由碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外,胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键,有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择。
对此等化学键的催化水解活性的敏感度为:
酯键>酰胺键>肽键。
因此,可以利用含有这些化学键的酰胺或脂类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺(简称BAPA或BAPNA,Cas:
911-77-3)和苯甲酰-DL-精氨酰-β-萘胺(简称BANA,Cas:
913-04-2)测定酰胺酶活力。
用N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(简称BAEE,Cas:
2645-08-1)和N-对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯(简称TAME,Cas:
1784-03-8)测定酯酶活力。
酶活力单位的规定因底物及测定方法而异。
2.3酶动力学研究
2.3.1米氏方程
式米氏方程
2.3.2抑制动力学
作用特征
无抑制剂
竞争性抑制
非竞争性抑制
反竞争性抑制
与I结合的组分
E
E、ES
ES
动力学参数
表观Km
Km
增大
不变
减小
最大速度
Vmax
降低
林-贝氏作图
斜率
Km/Vmax
纵轴截距
1/Vmax
横轴截距
-1/Km
2.4聚丙烯酰氨凝胶电泳
2.4.1PAGE凝胶的组成
a)单体(monomer):
丙烯酰胺(acrylamide,Acr),CH2=CH—CO—CH2。
b)交联剂(crosslinker):
N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis),可将两个丙烯酰胺单体分子连结在一起,可形成分叉点,以构成立体结构。
c)加速剂:
四甲基二乙胺(tetramethylenediamine,TEMED)帮助AP生成硫酸自由基。
d)化学聚合催化剂:
过硫酸铵(ammoniumpersulfate,AP)或riboflavin(即维生素B2)在TEMED催化下产生自由基(S2O82-→2SO4-·
);
产生的硫酸自由基激活Acr单体。
2.4.2电泳的浓缩作用
图A:
上述电泳的五个部分中,只有凝胶的缓冲液含氯离子,没有Gly;
然而样品溶液中含Gly,没有氯离子。
再看样品溶液-浓缩胶-分离胶三段的pH是不连续的,其pH分别为8.3-6.9-8.9,注意Gly的pI恰为6.9。
图B:
当电泳一开始时,Gly进入浓缩胶,立刻变成不带电的分子(白点),泳动率变小;
同时氯离子则很快的往正极泳动,因此在氯离子与Gly之间有一段缺乏离子的空间,电压变得很高。
然而两电极之间,一定要有负离子来带动电流,此时只有利用蛋白质分子来传递,而浓缩胶中的孔隙有较疏,于是蛋白质分子在此离子缺乏空间,快速往正极泳动,一直碰到氯离子的尾端,而聚集于此,形成一薄层。
图C:
Gly分子慢慢通过浓缩胶,又变回负离子,离子缺乏空间瓦解;
样品蛋白质泳动到分离胶,胶体为正常浓度,依其分子量、电荷等因素泳动。
2.4.3PAGE染色及干燥
凝胶在电泳后要进行染色,才能看到样品蛋白质所呈现的条带。
下面介绍两种常用的染色方法。
考马斯亮蓝染色法:
CoomassieBrilliantBlueR-250(CBR)是最常用的染色法,快速而方便,灵敏度中等。
利用CBR上的芳香基团与蛋白质的非极性区结合,以及所带负电与蛋白质的正电基团结合。
注意染色用的CoomassieBrilliantBlue为R-250,不要误用G-250,后者用于蛋白质定量。
硝酸银(ammoniacalsilver)染色法:
以银氨错离子形式与蛋白质结合,银离子再还原成金属银的深褐色。
其灵敏度比CBR染色法高十至百倍,但步骤较复杂。
凝胶的干燥保存:
大部分的凝胶经过脱水处理做成干胶均可长期保存。
干燥好的凝胶,可用扫描仪扫描,再与标准蛋白质相比较则可定量。
3实验材料(设备)
3.1实验材料
3.1.1实验原料
新鲜鸡蛋,胰脏抽提液
3.1.2实验原料来源
北京理工大学珠海学院化工与材料学院生物工程实验室
3.1.3凝胶配置
3.1.3.1Disc-PAGE/SDS-PAGE分离胶(T=12%,C=3%)配方
H2O3.3mL,30%Acrylamide4.0mL,1.5MTris-HCl2.5mL,10%SDS0.1mL,TEMED0.006mL,10%过硫酸铵0.1mL
3.1.3.2Disc-PAGE/SDS-PAGE浓缩胶(T=5%Acrylamide,C=3%)配方
H2O3.4mL,30%Acrylamide0.83mL,1.0MTris-HCl0.63mL,10%SDS0.05mL,TEMED0.010mL,10%过硫酸铵0.05mL
3.1.4.实验试剂
表3-1主要试剂及其生产厂家
药品、试剂
厂家
丙酮
实验室提供
甲壳素
考马斯亮蓝G-250试剂
亲和柱平衡液
BAEE底物溶液
0.05M,pH8.0Tris-HCl缓冲液
标准蛋白溶液
亲和柱洗脱液
蒸馏水
分离胶缓冲液
浓缩胶缓冲液
10%SDS
电泳缓冲液
考马斯亮蓝染色脱色液
考马斯亮蓝G-250染色液
自来水
3.1.5实验主要设备与仪器
表3-2主要仪器及其型号
仪器名称
型号
生产厂家
超净工作台
ZHJH-C1115B
上海智诚
蠕动泵驱动器
BT100-2J
LongerPump
架盘药物天平
JYT-2
上海光正医疗仪器有限公司
台式离心机
SC-3610
科大创新股份有限公司中佳分公司
低速离心机
SC-3612
安徽中科中佳科学仪器有限公司
离心机
TDL-408
Anke
酸度计
PHS-3C
雷磁
可调高速匀浆机
FSH-2A
透析袋
MD77
Solarbio
微量移液器(10.00)
DU32080
DRAGON-MED
微量移液器(1000)
DS06805
微量移液器(200.0)
DS06605
4实验方法
4.1实验流程示意图
v
图4-1实验流程示意图[18]
4.2胰蛋白酶的亲和配基-鸡卵粘蛋白的分离与定量
4.2.1有机溶剂沉淀法
当蛋白质溶液加入大量有机溶剂,水分子浓度被稀释,蛋白质的溶解度便迅速下降,而沉淀下来。
但有机溶剂与水混合后会产生热,易造成蛋白质变性,需在极低温下操作。
常用有机溶剂有丙酮或甲醇,在沉淀后也常用乙醚来带走丙酮,以加速干燥。
4.2.2TCA沉淀法
另外,三氯乙酸(trichloroacetic,TCA)是很强的蛋白质变性剂,许多蛋白质遇到TCA都会变性沉淀,无法恢复原态。
TCA对皮肤有很强的腐蚀性,不小心接触后要马上冲水。
通常TCA并不被用在纯化蛋白质的步骤中,而是用来沉淀或移除大部分非目的蛋白。
4.2.3高速离心法
离心是分离固态与液态最方便的方法,因此蛋白质以上述方式沉淀下来后,接着便可用高速离心法,把形成固态或半固态的蛋白质分离出来。
这样的离心都要在低温下进行,以免离心时产生高温,导致目的蛋白变性。
在实验室中,高速离心机是较危险的仪器,一定要注意离心管是否正确平衡,离心转速是否设定正确。
[3]
4.2.1蛋白质盐脱
透析袋是最长常用的方法,透析袋有各种大小不同的网目,可以分离分子量不同的大小分子。
透析袋一般使用前需经前处理。
4.2.1Bradford法定量蛋白质
Bradforddye-bindingmethod是利用Coomass
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