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新窖泥;
有效磷;
氨态氮;
腐殖质;
芽孢杆菌
EffectsofAddingPhosphorusonMainPhysiochemicalIndexesIntheProcessofNewPitMudCultivation
ChengNeng
(DepartmentofBiologyandChemistryEngineering,ShaoYangUniversity,ShaoYangHunan,422000)
Counselorteacher:
YuYou-gui
Abstract
TheexperimentsaretextedwiththenewculturedpitmudfromJinLiuFuwineindustryCompany.Duringthecultivation,afteraddedacertainamountofphosphorus,throughstudyingthechangesofthemainphysiochemicalindexes(water,pH,effectivephosphorus,potassium,etc)andthetotalnumbersofbacteriumandBacillusinthenewpitmudcultivation,thesewouldprovidetheoreticalbasisforindustrypit-mudcultivationandimprovements.Theseexperimentsincludedseveralmainmethods:
usingbakingmethodandPHdollarstotestthemoistureandPHvalueinpitmud,usingheavychromicacidpotassiumoxidationmethodtotestthehumuscontent,adoptingtheflatpanelofcolonycounttoaccountthequantityofbacteriaandbacillus,usingtheflamephotometricmethodtodeterminethecontentofeffectivephosphorusandpotassium,andusinghalfminimKielDahlmethodtogetthecontentofammonianitrogen.Theexperimentalresultsshowedthat:
Intheprocessofcultivation,theamountofeffectivephosphorus,,bacilluspopulationandthetotalbacterialareincreased,andammonianitrogen,moisture,PHaredeclined.Afteraddedaamountofphosphorus,thecontentofeffectivephosphorus,potassiumandbacteriagrowsmorequickly,otherphysicalandchemicalindexesaresimilartothepitmudbefore.Theexperimentprovedthatpitmudaddedwithphosphorushaslargeeffectsonthecontentofphosphorus,potassiumandthenumberofbacterial,butlittleeffectsonotherphysiochemicalindexes.
Keywords:
newpitmud;
effectivephosphorus;
ammonianitrogen;
humus;
bacillus
目录
中文摘要
英文摘要
前言1
1材料与方法4
1.1材料、仪器与试剂4
1.2PH与水分的测定方法5
1.3窖泥微生物检测…………………………………………….....................5
1.4腐殖质的测定……………………………………………………………6
1.5有效钾、有效磷含量测定……………………………………………….7
1.6氨态氮的测定……………………………………………………………9
2结果与分析10
2.1新窖泥与补磷窖泥培养过程中理化指标的对比10
2.2新窖泥与补磷窖泥培养过程中微生物变化的对比11
3结论12
参考文献13
致谢14
前言
自古以来,窖池都是浓香型大曲酒生产的主要设备和重要的前提条件,要产好酒,就必须有优质的窖池,而好的窖池其本质在于优质的窖泥,因优质老窖泥中生长着大量经长期驯化、富集的有益于酿酒的微生物群落,它们和曲药中的微生物一起,通过发酵作用,分解利用粮食谷物中的营养物质,产生酒精和一系列复杂的香味成分物质,造就了优质的大曲原酒。
而且,优质的窖泥能赋予大曲酒一种特殊的香气“窖香”,从而大幅度提高了酒的档次,这是任何外加手段都无法达到的。
因此窖泥对浓香型大曲白酒的生产,尤其是高档白酒的生产,起到了至关重要的作用。
各浓香型白酒生产企业也都把培养窖泥、养窖护窖作为提高产品质量和优质品率的重要措施之一。
浓香型大曲酒的酿造,窖池是基础,随着对微生物在白酒工业应用研究的深入,“百年老窖”的奥密已步被人们揭示,其实质是在窖泥中栖息有以细菌为主的多种微生物,以香醇为养料来源,以香酷和窖泥为活动场所,经过微生物菌群的缓慢生化变化,才产生了浓香型的以己酸乙醋为主体的香气成分。
因此要酿制优质浓香型大曲酒,就必须了解优质窖泥中的重要微生物体,了解并撑握这个复杂的菌系,有助于控制工艺条件,促进酿酒有益菌的生长,以提高产品的产量与质量。
另外,浓香型白酒生产中,窖泥对酒的质量影响很大。
浓香型白酒生产素有“千年窖泥万年糟”,“以窖养糟”,“以糟养窖”等说法。
由此可见,窖泥对浓香型白酒生产的重要性。
窖泥的理化指标可以衡量一个酒厂窖泥的质量,北斗科研组曾专门对浓香型白酒窖泥进行了研究测定了窖泥水分、pH、氮、磷、钾以及腐殖质等理化指标。
而且沱牌酒厂还制订了窖泥质量鉴定标准,使人们对窖泥制备及维护的认识更深一层本研究通过对不同窖龄生产窖池成熟窖泥相关理化指标的测定、认识窖泥、土壤的理化特征。
有利于依据企业实际情况制订出符合企业需求的窖泥质量标。
四川素称名酒之乡,尤其是其浓香型白酒更是驰名中外。
年的全国酒类评比会上,四川荣获全国名酒称号的五个白酒中,就有四个属浓香型白酒。
在全国各种香型的名优白酒中,浓香型也占绝对优势。
因此,对浓香型白酒微量成份的研究有着普遍意义。
四川浓香型白酒中的有机芳香成份的研究近年来取得了较大进展,检出了几种种微量成份,并对其中一些进行了定量测定。
但是对酒中的无机微量成份的研究却进行得较少,仅有儿篇用原子吸收、紫外荧光和质子荧光分析法测定的报道。
这些研究的元素仅限于十几种,研究用先进的仪器中子活化分析,测定了四川省有代表性的八个浓香型白酒及它们的酿造窖泥中几种种微量元素的含量,
浓香型白酒的发酵过程与窖池中微生物复杂的物质能量代谢紧密相连,窖池中理化因子与其存在的微生物彼此联系、相互促进、相互制约、协调发展共同形成了窖池特定的微生物生态系统。
在微生物区系的演变过程中产生了丰富的代谢物质,这些代谢物质与白酒的风格密切相关。
窖泥是生产浓香型曲酒的基础,优质的窖泥是生产高质量浓香型曲酒的基本条件之一。
传统的优质窖泥,是通过长年不断周而复始的曲酒生产而自然老熟的(酿酒有益微生物的自然驯化),但这一过程往往要经过漫长的几十年,甚至更长时间。
自20世纪60年代发现浓香型“窖底香”以来,我国在人工窖泥的培养方面取得了飞速发展,大大缩短了窖泥老熟的时间。
近几十年来,我国20余个省、市、自治区数百家酒厂推广应用“人工窖泥”技术,获得了很大成功。
中国浓香型白酒的发酵过程实际上是各类微生物的代谢消长过程。
伴随着酒醅中各种物质形态的不断产生和消失,最终形成了与众不同的成分和风味特征,浓香型白酒的发酵过程与窖池中微生物复杂的物质能量代谢紧密相连窖池中理化因子与其存在的微生物彼此联系、相互促进、相互制约、协调发展共同形成了窖池特定的微生物生态系统。
目前有研究浓香型白酒发酵中糟醅微生物区系和理化因子的演变过程,以及特征香味成分的变化趋势,对浓香型白酒发酵机理进行探索本实验通过跟踪发酵过程中不同层次糟醅香味成分的变化以及微生物的生长趋势。
为了进一步了解和掌握白酒酿造过程中各类微生物的演变规律,深入探讨窖池发酵机理和物质变化规律与产品质量之间的关系,以利于更好地指导白酒生产。
首先需要掌握快速而准确的微生物分离方法目前对糟醅微生物分离的研究。
不同的报道所采用的方法不尽相同,如熊昌绪分离霉菌和酵母所采用的培养基与张文学等人报道的就有所不同,现有报道中没有涉及到建立一套系统的、简便快速分离糟醅中微生物的方法。
使得分析出来的数据更具有对比性,更有利于开展进一步的糟醅微生物的研究。
酿造浓香型白酒的微生物所需要的营养,这是培养窖泥微生物的关键。
我国疆土辽阔,东西南北土质相差很大,所以培养人工窖泥的配方不是一成不变的,要对所使用的材料进行分析检测后,合理调整。
分析检测的主要指标:
水分、PH、有效磷、氨态氮、腐殖质等。
浓香型名优酒的生产采用的是传统的固态发酵工艺,它强烈依赖于窖池,而窖池中窖泥质量的优劣对浓香型白酒的质量起着非常重要的作用,传统的新建窖池,一般要在连续使用20~30年才能通过自然老熟生产出优质酒。
随着白酒行业的发展和酿酒生产技术的进步,利用现代微生物技术进行人工窖泥培养,可使新窖在较短的时间内达到一定窖龄的窖泥质量水平,从而大大缩短窖池中窖泥的自然老熟时间。
为此,许多地方开展了人工窖泥培养技术的研究,对人工培养窖泥过程中的微生物变化进行跟踪测定,人工窖泥用于新建窖池,提高浓香型白酒的优质比率。
窖泥是浓香型白酒主体香产生的必要条件。
传统生产的浓香型白酒主体香,是通过长期自然发酵所培育的老窖泥中微生物生成的。
并在全国推广,取得了显著的经济和社会效益。
可以说“人工老窖”技术的推广使用,为我国白酒工业的发展做出了卓越的贡献。
但是,任何一项科学技术的发明都不是尽善尽美的,随着时间的推移,必然暴露出其不足和需完善之处。
我国各厂普遍存在的窖泥退化的主要问题,许多厂为了防止窖泥老化与科研单位及大专院校共同进行研究对策,不论在墓理上或应用上都取得了丰硕成果。
在操作中尽量减少铁、钙并尽量采取降乳措施已收到良好效果由于窖泥中营养成分不断消耗而减退或己酸菌数不断下降,各厂采取人工养窖,以延长窖龄防止老化。
窖泥表面撒曲粉及用酒精喷洒等。
而喷洒己酸菌培养液的效果极佳。
以养窖的方法保持窖泥处于旺盛期要比老化后更换窖泥经济得多。
新窖泥培养技术虽然取得了较大进展,但新窖泥培养过程中补充微量元素对窖泥质量影响的研究还少有涉及。
因此,本次实验通过对窖泥补磷后继续培养,找出补磷后的窖泥水分、PH等主要理化指标变化规律,为新窖泥的培养提供理论指导。
1材料与方法
1.1材料、仪器与试剂
1.1.1材料新窖泥:
来自四川金六福酒业有限公司培养的新窖泥。
1.1.2主要仪器火焰分光光度计、烘烤箱、超净工作台、PH计、瓷坩埚、细胞计数器、恒温培养箱、重铬酸钾、电子显微镜、电子分析天平、往复振荡机等
1.1.3试剂牛肉膏、蛋白胨、七重铬酸钾、氢氧化钠、0.1molL-1硫酸亚铁、0.5mol•L-1NaHCO3、中性醋酸铵溶液、钼锑抗试剂、磷标准溶液、4%硼酸溶液等。
1.2实验方法
1.2.1取样及补磷方案与主要研究参数的确定:
⑴取样及补磷方法:
本试验用窖泥取自金六福酒厂培养用新窖泥,分成两次取样,每次取样不超过200g。
为研究该窖泥的动态指标特征的变化,需分批进行定期检测。
⑵补磷方案:
分两批样,1号样(原样),2号样每kg窖泥加磷酸二氢铵5克和磷酸氢二钾2克,加水20-30克,充分溶解后,拌入窖泥中。
理论上有效磷含量为2×
0.1728+5×
0.43=2.5
⑶主要研究参数的确定:
理化指标的确定:
水分,有效磷,有效钾,铵态氮,有机质的成分的变化情况
①水分:
水分含量对窖泥的影响很大,直接影响窖泥的PH、腐殖质、微生物区系及生长状况,因此,须严格控制水分的含量,一般新窖水分含量为45.10%。
②PH:
窖泥的PH对白酒产品的质量、产量起着决定性的作用,适当的PH值不但能促进酒精发酵而且还能促进香气成分物质和前体物质的合成,一般新窖泥的PH值为5.64,窖泥的PH范围在PH4.0~6.5应呈酸性
③速效元素:
铵态氮是微生物分解有机质而形成的,有效钾主要为水溶性钾和代换性钾,有效磷多为植酸状态下的有机磷,是细菌和真菌分泌植酸酶作用后生成的,这些是酵母、细菌、霉菌等微生物生长、繁殖所必需的速效元素。
④腐殖质含量:
窖泥中腐殖质的质量是土壤中各种营养元素的重要来源,是土壤微生物活动的产物,是外来有机质经过土壤微生物作用后形成的多种有机化合物,是氨基及环状有机氮的化合物主要有胡敏酸和富里酸,其含量高低可以判断窖泥和土壤的优劣,可以全面反应窖泥微生物营养供应能力。
一般新窖泥中腐殖质含量占7.21%。
⑤生化指标的确定:
总菌数,芽孢杆菌数的生长变化情况
1.2.2窖泥水分、pH值测定
⑴、取小型瓷坩埚(记号笔做好标记)在105℃恒温箱中烘烤约2h,移入干燥器内冷却至室温,称重,准确至0.001g(m0)。
加鲜窖泥土样约5g窖泥于瓷坩埚中称重(m1)。
将瓷坩埚盖揭开,放在盒底下,置于已预热至105±
2℃的烘箱中烘烤12h。
取出,盖好,移入干燥器内冷却至室温(约需20min),立即称重(m2)。
风干窖泥土样水分的测定一组2个平行。
⑵、结果计算
水分(干基)%=
%
式中:
m0—烘干空瓷坩埚质量(g);
m1——烘干前瓷坩埚及土样质量(g);
m2——烘干后瓷坩埚及土样质量(g)。
⑶、测定窖泥水分可以使用PH计,首先应校正好仪器,把电极插入与窖泥浸提液pH接近的缓冲溶液中,使标准溶液的pH值与仪器标度上的pH值相一致。
然后移出电极,用水冲洗、滤纸吸干后插入另一标准缓冲溶液中,最后移出电极、用水冲洗、滤纸吸干后待用。
把电极插入窖泥液中,待读数稳定后,记录待测液pH值。
每个样品测完后,立即用水冲洗电极,并用干滤纸将水吸干再测定下一个样品。
两次称样,平行测定结果。
1.2.3窖泥微生物检测
窖泥细菌总数检测:
采用平板菌落计数:
首先给培养皿和试管编号,取无菌培养皿9套,分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6,每个稀释度3个重复;
另取6支盛有4.5ml无菌水的试管,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
⑴取1g窖泥溶解99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中,振荡10~20min,使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散。
并通过吸附沉淀、过滤制成菌体悬液。
用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中,用移液管吹吸三次、摇匀,此即为10-3浓度。
同样方法,依次稀释到10-6。
用3支无菌吸管吸取10-4、10-5、10-6的稀释液各0.2ml,放入相应编号的无菌培养皿中。
⑵倒平板培养:
加样的培养皿中倒入融化后并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约12到15ml,使样品和培养基混匀,待凝固后,倒置37℃恒温箱中培养。
⑶统计菌落数:
培养24h后取出,数出每个平板上的菌落数。
选择单个平板菌落数在30-300之间的稀释度,计算样品和菌浓度。
如果3个稀释度的菌落数都不在此范围内,选择最接近此范围的稀释度进行计算。
⑷芽孢杆菌数量检测
同细菌总数检测方法一样先将菌液稀释合适倍数后:
在80℃,加热处理菌悬液10min,涂布平板,35~37℃,培养2~3d,观察计数涂布到相应的固体选择培养基上,在适宜条件下培养,计数单菌落数,再乘以稀释倍数即可。
1.2.4腐殖质测定
用0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/L氢氧化钠混合液处理土壤,能将土壤中难溶于水和易溶于水的结合态腐殖质络合成易溶于水的腐殖质钠盐,从而比较完全的将腐殖质提取出来。
焦磷酸钠还起脱钙作用,提取的腐殖质用重铬酸钾容量法测定之。
⑴操作步步骤
1、称取2.50克烘干重的风干土样,置于250毫升三角瓶中,用移液管准确加入0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/L氢氧化钠混合液50.00毫升,振荡5分钟,塞上橡皮套,然后静置13—14小时(控制温度在20℃左石),旋即摇匀进行干过滤,收集滤液(一定要清亮)。
⑵胡敏酸和富里酸总碳量的测定
吸取滤液5.00毫升,移入150毫升三角瓶中,加3molL-1H2S04约5滴(调节pH为7)至溶液出现浑浊为止,置于水浴锅上蒸干。
加0.8000molL-1(1/6K2Cr207)标准溶液5.00毫升,用注射筒迅速注入浓硫酸5毫升,盖上小漏斗,在沸水浴上加热15分钟,冷却后加蒸馏水50毫升稀释,加邻啡罗林指示剂3滴,用0.1molL-1硫酸亚铁滴定,同时作空白试验。
⑶胡敏酸(碳)量测定
吸取上述滤液20.00毫升于小烧杯中,置于沸水浴上加热,在玻棒搅拌下滴加3molL-1H2S04酸化(约30滴),至有絮状沉淀析出为止,继续加热10分钟使胡敏酸完全沉淀。
过滤,以0.0lmolL-1H2S04洗涤滤纸和沉淀,洗至滤液无色为止(即富里酸完全洗去)。
以热的0.02molL-1Na0H溶解沉淀,溶解液收集于150m1三角瓶中(切忌溶解液损失),如前法酸化,蒸干,测碳。
(此时的土样重量w相当于1克)。
⑷结果计算
腐殖质(胡敏酸和富里酸)总碳量(%)=
式中:
V0—5.00毫升标准重铬酸钾溶液空白试验滴定的硫酸亚铁毫升数。
V1一待测液滴定用去的硫酸亚铁毫升数。
w一吸取滤液相当的土样重(克)。
5———空白所用K2Cr2O7毫升数
0.8000———1/6K2Cr207标准溶液的浓度;
0.003——碳毫摩尔质量0.012被反应中电子得失数4除得0.003;
②胡敏酸碳(%):
按上式计算。
③富里酸碳(%)=腐殖质总碳(%)一胡敏酸碳(%)
④HA/FA=胡敏酸碳(%)/富里酸碳(%)
1.2.5窖泥有效钾的含量的测定
采用火焰光度计或AAS计
⑴主要仪器和试剂:
往复振荡机;
火焰光度计或AAS计。
中性醋酸铵溶液称77.08克醋酸铵(NH4OAC,三级)溶于近一升水中,用稀醋酸或氢氧化铵调节至PH7.0,用水定溶至1升。
3.钾标准溶液
称取0.1907克氯化钾(KCl,二级,110℃烘干2小时)溶于1mol醋酸铵溶液中,并用它定容至1L,即为含100ppm钾的醋酸铵溶液。
用时分别吸取此标准溶液2,5,10,20,40毫升放入100毫升容量瓶中,用1N醋酸铵定容,即得2,5,10,20,40ppmK标准系液。
⑵操作步骤
①称取风干土样<
过l毫米筛)5.00克于100毫升塑料瓶或三角瓶中,加入NH4OAc溶液50.0毫升(液土比为10),用橡皮塞塞紧,在25℃下振荡30分钟,用干滤纸过滤,滤液直接用火焰光度计或原子吸收分光光度计测定钾,记录火焰光度计的栓流计读数或AAS计上于766.5纳米处测K的吸收值。
然后从工作曲线上查得待测液的钾浓度(ppm)。
②工作曲线的绘制
:
将配制的钾标准系列溶液(2,5,10,20,40ppmK),以浓度最大一个定到火焰光度计上栓流计的满刻度100),然后从稀到浓依序进行测定,记录栓流计的读数。
以栓流计读数为纵坐标,钾浓度(ppm)为横坐标,绘制工作曲线或将配制的标准系列溶液直接在AAS计上于766.5纳米处测定吸收值后,绘制工作曲线。
⑶结果计算
速效Kppm=待测液Kppm*测定体积/样品重=待测液Kppm/液土比待测液Kppm——从工作曲线查得待测液Kppm数测定体积——待测液体积(50毫升)。
两次平行测定结果允许差为2ppmK。
1.2.6有效磷的测定
⑴方法原理:
0.5mol•L-1NaHCO3浸提,有利于吸附态磷的置换,方法原理:
碳酸氢钠碱溶液中存在着OH-、HCO3-、CO3-2等阴离子因此NaHCO3不仅适用石灰性土壤,也适应于中性和酸性土壤中有效磷的提取。
待测液中的磷用钥锑抗试剂显色,进行比色测定。
⑵主要仪器:
往复振荡机、火焰分光光度计。
⑶试剂配制:
①0.5mol•L-1NaHCO3浸提液:
溶解NaHCO342.0g于800mL水中,以0.5mol•L-1NaOH溶液调节浸提液的pH至8.5。
此溶液曝于空气中可因失去CO2而使pH增高,可于液面加一层矿物油保存之。
此溶液贮存于塑料瓶中比在玻璃中容易保存,若贮存超过1个月,应检查pH值是否改变。
②无磷活性炭:
活性炭常含有磷,应做空白试验,检验有无磷存在。
如含磷较多,须先用2mol•L-1HC1浸泡过夜,用蒸馏水冲洗多次后,再用0.5mol•L-1NaHCO3浸泡过夜,在平瓷漏斗上抽气过滤,每次用少量蒸馏水淋洗多次,并检查到无磷为止。
如含磷较少,则直接用NaHCO3处理即可。
③其他:
钼锑抗试剂、磷标准溶液。
⑷操作步骤:
称取通过20目筛子的窖泥土干样2.5g(精确到0.001g)于150mL三角瓶(或大试管)中,加人0.5mol•L-1NaHCO3溶液50mL,再加一勺无磷活性炭(注1),塞紧瓶塞,在振荡机上振荡30min(振荡速率每分钟150~180次),立即用无磷滤纸过滤,滤液承接于100mL三角瓶中。
同时做试剂空白
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