慢病毒感染的相关知识总结Word下载.docx

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1X1０8 

ＴＵ/mｌ　即每毫升病毒液中至少含有１Ｘ１0８个具有生物活性的慢病毒颗粒。

以24孔培养板为例,进行目的细胞和HEK29３T细胞的感染预实验实验前按照不同的ＭOI设置不同的感染孔，并根据MOＩ和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PＢS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

第一天，准备细胞：

在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种３~5X１0４个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右,每孔培养基体积为1０0μl；

进行病毒感染时细胞的融合度约为7０％左右。

第二天,准备病毒：

取出４℃保存的病毒，使用台式离心机离心20　秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；

如果是冻存在-8０℃的病毒需要先在冰上融化后使用。

亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。

第二天,感染目的细胞:

病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞,首先察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验。

ａ使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。

b吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜,则不用换液）。

c在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。

d混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、５%CO２）孵育过夜。

注：

感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。

亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中。

慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MＯI　值可以提高病毒的感染效率，但是当MOI高于20时，我们建议在培养基中加入plｏｙbrenｅ（８μg/ml左右）来提高病毒的感染效率。

第三天，更换培养液:

一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液;

在感染后观察细胞状态,如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态,可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。

第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。

第六天,感染效率检测：

在倒置荧光显微镜观察荧光,估计慢病毒感染目的细胞的效率；

如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带MarkeｒGene的,可以通过Reａl-timeRＴ-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。

注意：

有些慢病毒载体上带有ＧFP绿色荧光蛋白,使用者可以在病毒感染9６小时后用倒置荧光显微镜观察ＧFP　绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。

如果慢病毒载体携带其他MarｋerGene如ＲFP\ＢFP可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况。

慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后9６小时后观测荧光表达。

感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。

感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液,以保证细胞良好的生长状态。

三、慢病毒使用安全使用规范ﻫﻫ 

慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。

但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，不建议使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。

除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性,否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。

使用时请参照如下所示进行实验:

1.病毒操作时最好使用生物安全柜。

如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。

2．病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。

３.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。

如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SＤＳ溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管,培养板,培养液请于84消毒液或１%SDS中浸泡过夜后弃去。

４．用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：

拧紧培养瓶或盖紧培养板。

用7０%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。

离开显微镜实验台之前,用7０%乙醇清理显微镜实验台。

5．如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。

6．脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。

四、悬浮细胞感染方法概要

　１. 

根据细胞的量将细胞在1.5ml　管中离心收集然后用１０0-200ｕl的无血清培养液稀释细胞沉淀,以细胞完全浸没在培养基中为准。

2. 

按照MOI换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ｍl　管放在37℃度培养箱中孵育30分钟。

３. 

将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里。

4. 

加入足够量的新鲜培养液。

５. 

12小时后换液。

6. 

96小时后观察细胞阳性率。

五、相关专业术语:

ＭＯI：

病毒感染复数传统的ＭOI　概念起源于噬菌体感染细菌的研究。

其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。

噬菌体的数量单位为ｐfu。

一般认为MＯI是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是pfunumber/ceｌl。

后来ＭOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，本手册中提到的ＭOI都是沿用这个概念。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使ＭＯＩ产生了不同的含义。

能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量,因此其MＯＩ的含义与传统的概念相同。

六、细胞培养器皿的相关参数ﻫ 

Flaｓk/Dish

Suｒface　（mm）

Cｅllnumｂeｒ

Media　Voｌume

96ｗellpｌate

５0

1.5-５.0×

10

100　μl

４8weｌlplate

10０

3.0×

10４－1.0×

２00μl

24wellplatｅ

２00

8．0×

1０4-2．0×

5０0　μl

12ｗellpｌate

401

1.6-４.0×

１０

1.0ml

6wellplate

962

３．0-8.0×

2.0mｌ

３5mm

3.0-8.0×

2.０　mｌ

60mm

2８２7

1.０-2．5×

６．0　ml

10０mm

7８５４

２.５－6.4×

1０

１０.０ml

慢病毒

重组慢病毒简介

在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中，重组慢病毒载体是一个强大和有效的工具。

慢病毒能作用于细胞周期的G０/Ｇ１期,同时具有嗜核性,所以可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞，感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞。

慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好、免疫反应小等优点。

所以获得了较广的应用范围。

慢病毒载体也是RNAi表达的主要手段，同化学合成和酶切形成的ｓiRNA相比具有几个优点：

其一，可以携带ＧFＰ或萤光素酶等报告基因共表达,便于跟踪、选择和富集转染的细胞；

其二，可以根据需要表达不同类型的小RNA分子（siRNA、shRＮA或miRNＡ）;

其三，具有较高的转染效率,使基因沉默维持较长时间。

目前Pubmed中收录有关慢病毒载体用作实验的文章超过7万多篇,仅Naturｅ，,Sciencｅ,，Ｃｅll上便超过6０0篇。

已成为国际上最通用的转染系统,广泛用于各类实验室。

慢病毒的安全操作规范

深圳百恩维提供的慢病毒均采用第三代系统的慢病毒载体。

水泡性口炎病毒来源的VSV-G基因代替ＨIＶ－1的env基因，这既提高了慢病毒的安全性,又使其能够感染的细胞种类大大增加。

本系统的慢病毒颗粒是“自身失活型（ＳIV）”,整合入靶细胞后，不会产生完整长度的RＮA，仅仅具有携带目的基因的功能，感染目的细胞后不再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险性，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假性病毒;

并强烈建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物,而且严格遵守ＢSL-2或ＢSL-2＋操作手册并进行相应的废弃物消毒。

基本操作规范如下:

1、在实验室工作时,任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服;

应戴上合适的手套和口罩。

２、病毒操作时最好使用生物安全柜。

如果使用普通的超净工作台操作病毒,请不要打开风机。

3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。

如果出现病毒污染，请立即用70%的酒精加1%SＤS溶液擦拭干净。

4、如需离心，应使用密封性好的离心管，可用Ｐarafilｍ膜封口后离心，而且最好使用组织或细胞培养室内的离心机。

５、用显微镜观察细胞感染情况时遵从以下步骤：

拧紧培养瓶或盖紧培养板,并在使用７0%乙醇清理所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前,必须清除污染。

废弃的含病毒的培养基加入84消毒液（1:

20左右）,浸泡一天后丢弃。

接触过病毒的枪头,离心管,培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理,也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（１21℃,30mｉn）。

6、手套用完后,应先消毒再摘除，随后必须洗手。

详细操作规范请参阅卫生部发布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS２３3-20０２）、美国疾病控制中心出版的《微生物和生物医学实验生物安全（第五版）》和世界卫生组织出版《WＨO生物安全手册》。

操作慢病毒时请依照现有的使用指南。

包装细胞293T细胞

（下述流程来自深圳百恩维,如果使用不同公司系统请参考各公司提供的方案,本流程仅供参考）

293Ｔ细胞的冻存

1、随着传代的次数增加,２93T细胞会出现生长状态下降，出现突变等,所以要在细胞购进时就进行备份。

2、在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3、倒去细胞上清液，加入D-Ｈanｋ＇s液洗去残留的培养基。

4、加入0．25％的胰酶，消化10-20s后倒去。

５、镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

６、细胞计数。

７、将细胞离心,１0０0ｒpｍ,２min。

８、根据计数结果加入细胞冻存液（7０%完全培养基＋20%ＦBS+10%DＭＳO）重悬细胞,密度为3×

10６个/ml。

1０、第二天将细胞放入液氮灌,并记录。

２9３T细胞的传代

１、当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。

2、消化细胞，方法同上。

３、细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。

密度为３×

105个/ml。

4、分到１0cm培养皿中，1０ｍl/皿。

2９3T细胞的复苏

１、当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

２、打开水浴锅，设置温度为37℃。

3、查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤）,迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2　min内使细胞溶液完全溶解。

4、将1ml细胞溶液加入9　ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

５、放回37℃、5％CＯ2和9５%相对湿度的培养箱中培养。

6、第二天观察细胞存活率。

倒掉旧的培养基,加入10ｍl新鲜培养基。

慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

１、所用病毒检测引物为ＷPRＥ特异引物，序列如下

5'

－CCＴTTCＣGＧGＡCTTＴCＧCTTＴ-3'

（forwarｄ　priｍｅｒ）,

-GCAGＡATＣＣAＧGTGＧＣAAＣA-3＇（reｖｅrseｐrimer）ａｎｄ

－FＡＭ-ACTＣATCGCＣＧCCTGCCＴTGCC-TAMRA-3＇（pｒｏbｅ）

2、TaｑＭanUｎｉversａlＰＣRMastｅｒMix（Appliｅｄ　Biosyｓｔｅｍｓ, 

ｃaｔ.no．４３04437）

3、TａqMaｎDNＡTemｐlaｔeReagｅnt　Ｋｉt（ＡｐplｉｅdＢｉｏsystｅms， 

ｃat.　no.401970）

4、TaqManRNasｅPcoｎtroｌｒeaｇeｎt　（ＡppliｅdBiosyｓｔems， 

cａt.　nｏ.4３16844）

用于包装的２9３T细胞（ＡTCCＮo．　CRL-1１268）必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳,存活率90%以上，细胞边缘清晰,传代次数较低。

任何时候细胞汇合率都不准达到100％。

慢病毒的包装

１、预先准备3个T１50瓶的293Ｔ细胞,培养基为DＭEM　+10%FBＳ,1%　Glutamax 

１％ 

青霉素-链霉素。

2、将细胞分到12个T15０瓶中，每瓶的细胞密度是８×

106个。

3、第二天，镜下检查细胞。

细胞融合度应大致为30－40%,分布均匀。

4、转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti－MＥM培养基，将细胞送回培养箱。

5、取两支无菌的50ml离心管,其中一支中加入252μgpＮL-EＧFＰ/CＭV/ＷPＲEDＵ３ 

载体质粒,168　μｇpＣD／NL－BH*DＤＤ 

包装质粒和８4μgpＬTR-G质粒，用Oｐｔｉ-MEＭ培养基补齐到18ｍl。

另一支中加入500μl　Trans-EＺ溶液和1７．5ｍlOptｉ－MＥＭ培养基,用电动移液器轻轻混匀。

将Trａns-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤:

推荐使用Ｑｉagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6、室温孵育2０分钟,使DNA和Tｒans-ＥＺ充分结合形成转染复合体。

7、取1支5ml的移液管,将得到的DＮA-Trａns－EＺ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。

来回晃动培养板,混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。

每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

８、6小时后,移去细胞上清,更换为17ml的DＭEM完全培养基。

９、转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。

如果所转染质粒带有GFP荧光,那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

1０、将细胞送回培养箱继续培养２天（36-48小时）。

在这个过程中,细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11、收集所有的上清，分装到５0ｍｌ离心管中。

12、4℃，500ｇ离心1０分钟,除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13、总的上清约为204mｌ，用250－mｌ　0.4５μｍＰＶDＦ过滤装置过滤。

如果发现滤膜被堵住,表现为过滤速度变慢,更换新的滤器。

慢病毒的浓缩与纯化

方法一:

超速离心沉淀法

1、取6个Ultrａ－cleａｒ　ＳW２8离心管,用7０%乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒３0分钟。

2、每个Ultrａ-ｃlearSW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。

3、取一支10ml的移液管，吸取1２ｍl2０%的蔗糖溶液。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4mｌ。

同样地,将剩下8ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下３管进行同样处理。

４、用ＰＢS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过０．1g。

5、按次序将所有6个离心管放入BeｃｋｍanSW２8 

超速离心转头中。

6、小心将管子从转头中取出。

倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。

吸掉剩余的液滴。

在管底应当有可见的沉淀。

7、每管中加入100mｌ 

不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

8、将SＷ28超速离心管插入到50mｌ锥底离心管中，盖上盖子。

9、在４℃溶解２小时,每隔20分钟轻轻震荡。

1０、4℃,500g离心1分钟,使溶液集中于管底。

11、用20０μｌ 

移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

将所有管中的液体集中到一个SW２８离心管中。

1２、集中后的病毒悬液分装成50μl 

每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-8０　℃。

方法二 

PEG-80０0浓缩法

5XPEG8０00+NaCl配制称取NaCl8.766g;

PEG80０050ｇ溶解在200mｌＭｉlli-Q纯水中;

１２1摄氏度 

30mｉn 

湿热灭绝 

30miｎ；

保存在4℃。

1、使用０．４5μｍ滤头过滤慢病毒上清液;

2、每２0～30ｍin混合一次，共进行3-5次;

３、4度放置过夜；

4、4度，4000ｇ,离心 

２0miｎ；

5、吸弃上清，静置管子１～2分钟,吸走残余液体;

6、加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀;

7、集中后的病毒悬液分装成５０μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80℃

病毒滴度的测定

稀释计数法

滴度单位：

TU/mｌ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。

”TU”为”trａnｓduciｎｇ　uｎits”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备

将生长状态良好的２93Ｔ细胞消化计数后稀释至1×

105/ml,加入9６孔板，100μl/孔,为每个病毒准备10个孔。

放入37℃，５%CO2培养箱中培养。

第二天加病毒

在EP管中做1０倍梯度稀释，连续10个稀释度。

稀释方法如下:

每种病毒准备1０个1.5ｍlＥP管,每管加入90μl培养液,往第一个管中加入10μl病毒原液,混匀后，吸取10μｌ加入第二个管混匀。

依此类推,做十个稀释度（1０～１０-８）。

吸取９6孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。

并做好标记。

第三天追加培养液

在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。

假设为X和Y,则滴度（TU/ml）=（X＋Y＊10）＊１0０0／2／X孔的病毒液的含量（μl）。

定量PCＲ法

病毒感染1天前,取6孔板接种HOS细胞，每孔细胞为5×

104个。

接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数,确定感染时细胞的实际数目，记为Ｎ。

弃去其他培养板中的培养基,更换为含有5μｇ/ｍlpoｌybreｎｅ的新鲜培养基。

将浓缩病毒用培养基稀释2０0倍,也就是取1μl病毒加入到1９9μｌ的培养基中。

在3个培养孔中分别加入0.５μl，5μｌ和50μl的稀释病毒。

感染开始后20小时,除去培养上清，换为500μｌ含DNaseI（TａkaraMirｕs　Bio,终浓度为１0　U/ml）的新鲜培养基。

在37℃消化１5分钟,这一步是要除去残余的质粒ＤNA。

然后换为２ml正常的培养基,继续培养48小时。

用0．５mｌ0．2５%胰酶-EＤＴA溶液消化细胞,在3７℃放置1分钟。

用培养基吹洗下,离心收集细胞。

按照ＤＮeasy试剂盒的说明抽提基因组ＤNA。

每个样品管中加入2００μl洗脱液洗下ＤＮA。

用DNA定量试剂盒定量（Ｂio-Ｒaｄ）。

基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。

准备PCR所需的试剂和样品。

为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：

2×

　TaqMaｎMａstｅr　Miｘ

25μl×

n

Forwardpｒｉmer　（100pｍolmｌ-１）

0.1μl　×

　n

Rｅveｒseprｉｍer（100pmol　ml-1）

0.1μl×

Proｂe（1０0pｍol　ml-1）

Ｈ2Ｏ

19.7μl×

n=ｎumberofreactions. 

例如：

总反应数为40,将1mｌ2×

TaｑＭanUniversalPCR　ＭａｓtｅrMix，４μlforｗaｒdprｉmer，4μlrｅveｒseprimer,4μｌ　proｂe 

和78８μl　Ｈ2O混和。

震荡后放在冰上。

为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ:

２×

TaｑMaｎ　Masｔer　Mix

10×

RNａsePprｉmer／probeｍｉｘ

２．5μｌ×

ｎ

H２O

17.５μｌ　×

n　=ｎuｍbｅｒ　ofreacｔions. 

总反应数为40,将１mｌ2×

TａｑMａnＵnｉvｅrsａｌＰＣRMaｓterＭix，100μl　１０×

RNaｓｅP　priｍeｒ/probemix和70０μlH２Ｏ混和。

在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。

从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取4５μｌ加入到E-G各行的孔中。

分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNＡ加入到A-D行中,每个样品重复1次。

另留1个孔加入5μｌ的水做为无模板对照（nｏ-ｔemplateconｔrｏｌ）。

分别取５μｌ基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到Ｅ-Ｇ行中，每个样品重复１次。

另留１个孔加入5μl的水做为无模板对照（nｏ－teｍplatecoｎtｒｏl）。

所使用定量PＣR仪为AＢIPRISM７00０定量系统。

循环条件设定为：

50℃2分钟