生物发酵系统与设备的URSWord文件下载.docx

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结合GMP对设备的要求以及生物发酵本身的特点,在编制生物发酵系统设备URS文件时应具备下列几个条件：

（1）设备（发酵罐）的材质要求。

与培养基（包括补料物质）、发酵液（微生物、细菌、疫苗、细胞等）相接触的材质必须是无毒性、耐腐蚀、不吸收上述物质、不与上述物质发生化学反应的材料制成。

经常选用的材料是316L、304L、304、316；

（2）生物发酵罐因整个生物培养需在无菌条件下进行,罐体要有SIP过程,所以在制作过程中应符合《钢制压力容器》（150-1998）、《钢制压力容器焊接规程》（JB/T4709-2000）、《承压设备无损检测》（JB/T4730-2005）以及《压力容器安全技术监察规程》等标准。

同时，发酵罐的内表面应光滑、无死角,防止积沉物料,发酵结束后易清洗灭菌；

（3）生物发酵罐的外接件应坚持三个方便，即安装拆卸、清洗灭菌与操作维修方便,并能承受高压蒸汽灭菌；

（4）生物发酵罐在培养过程中涉及活性物质,因此须符合生物安全标准,既要做到防止一切外界微生物的污染，也要能防止发酵罐内的培养物质不污染周围环境。

因而，生物发酵罐应该是一个密封性能良好的系统装置,其放空、排放罐内气体与液体等需经过滤装置除去活性物质；

（5）生物发酵罐应具备优良的传质/传热效果、优良的物料混合性能，以便于提供培养物的最佳生长温度。

在进行动物细胞培养时，除了能充分混合均匀外，又要做到不能打碎动物细胞，以保证生物发酵培养过程的顺利进行。

2.3培养工艺对生物发酵系统的要求

2.3.1培养基的配制、灭菌和输送方式

生物发酵是一群生物体的生长繁殖过程，而培养基是提供给微生物或细胞生长、繁殖并按一定比例配制而成的一组营养物质。

一个良好的合适的培养基配比是经过不断实践、调整与改进而筛选出来的最优化组合，它的基本组分是由碳源、氮源、无机盐类（微量元素）等组成。

培养基（包括发酵过程中的补料物质）的理化性质、配制方式都应描述清楚，作为制订URS文件的依据。

培养基配制后的灭菌方式是采用热力灭菌还是过滤除菌、配料罐的大小、搅拌型式等也应一一描述出来。

此外，配比后的贮存方式以及输送到下工序（种子罐，发酵罐）的方式是用压缩气体输送、真空输送，还是采用泵输送，这些须在URS文件中描述。

2.3.2生物发酵过程

编制生物发酵系统技术文件的基础是为了解生物发酵的过程。

影响发酵过程的主要因素如下，其应在URS文件中详细注明其控制范围和控制方式。

（1）温度对生物发酵过程的影响。

温度是影响微生物或细胞生长发育的主要因素之一，大多数微生物或细胞的培养温度都是嗜中性的，这要求对培养过程中发酵液的温度加以控制。

根据不同品种及不同的生长阶段对发酵罐内的温度加以控制调节，从而选择最适合的培养温度，以利发酵过程的顺利进行。

（2）pH对发酵过程的影响。

发酵液的pH值会直接影响微生物或细胞的生长与繁殖。

培养基的种类、微生物或细胞的代谢过程都会影响发酵液的pH值。

为了保障生物发酵的正常进行，必须随时对发酵液中pH进行调节与控制。

方式有多种，可以直接加入酸碱进行调节，也可以选择合适的培养基，或加入某些不影响发酵的缓冲剂进行调节。

此外，pH调节方式及pH值控制范围的描述关系到生物发酵系统中pH调节装置的配备。

（3）通气搅拌（溶解氧）对发酵过程的影响。

对培养液进行通气搅拌直接关系到氧在培养液中的溶解量，并影响发酵物的产量。

对需氧发酵的品种而言，必须在有氧的条件下才能正常生长繁殖，为了增加培养液中氧的含量，须对培养液进行通气搅拌加速氧在培养液中的溶解和传递。

微生物或细胞在不同的生长期对氧的需求量也不同，用什么方式与如何调节含氧量均应描述清楚。

一般可以通过调节搅拌的转速和通气的流量，来加以控制。

（4）泡沫的产生对发酵的影响。

由于大量空气的通入并与培养液进行气液混合，发酵过程中的通气加上机械搅拌，极易产生泡沫。

大量泡沫的产生不仅使发酵罐的装填系数降低，而且能使发酵液从排气管或轴封处产生逃液现象，相应产量减少，通气效果下降，抑制了生物的生长与繁殖。

而这种以无菌空气和生物代谢时产生的气体为分散相，以培养液为连续相形成的泡沫，可以用机械方式或加入化学消泡剂办法加以消除，在编制文件时也应注明用什么方式消除泡沫。

（5）中间补料对生物发酵系统的影响。

中间补料指的是在发酵过程中，针对生物生长的不同时期补充某些营养物质，其可以满足生物生长繁殖的需要，提高发酵的产量。

中间补料以补充碳源和能量物质，如糖类（液化淀粉、麦芽糖、葡萄糖、乳糖等）、氮源（如酵母粉、蛋白胨、尿素等）及微量元素（如磷酸盐，ZnSO4、CoCl2等），当然中间也有补水或补全料（按培养基配比）。

另外，中间补料方式有流加式或滴加式，这种方式兼用或单独使用。

（6）培养物（生物）的代谢对发酵过程的影响。

微生物或细胞在培养过程中在一系列酶的作用下，不断地生长、发育、繁殖与增大，培养液中的成分也不断地变化。

如何去掌握这些因生物代谢而发生的变化？

使生物发酵朝着有利于提高产量的方向发展，可以通过分析监控与调节细胞的数量（含量，效价，表达率等）、pH值、糖的含量、氨基酸与氨氮的含量、磷的含量以及细胞浓度与形态来加以控制。

（7）特殊要求对生物发酵过程的影响。

在生物发酵系统中，还有一些特殊方式常被采用，尤其是在哺乳动物细胞的发酵培养过程中，常用微载体发酵的方式进行生物培养，在URS文件中也必须加以描述。

微载体顾名思义指的是直径50～250μm，能够适合细胞贴壁生长繁殖的一种微珠，微载体发酵是常用的一种细胞培养方式。

在生物发酵中常用的培养方式有二种：

一种是悬浮培养（培养对象悬浮于发酵培养液中生长繁殖）；

另一种是贴壁培养（培养物附着于固体表面生长繁殖），如某些哺乳动物细胞的培养可以利用微载体比表面积大、均匀性好、表面光滑，利于细胞贴壁附着生长，采用微载体贴壁培养加悬浮培养的方式进行发酵。

由于微载体对细胞无毒害作用，与动物细胞相容性好，更利于这种表面比较脆弱的细胞的生长与繁殖。

（8）对进行微载体发酵的项目在发酵罐、工艺管道、泵、配料罐等装置都要与之相适应。

此外，还有气升式发酵，若培养工艺有此要求也应列出加以说明。

2.3.3发酵液分离方式与收集

生物发酵结束后，有的品种收集发酵液的上清液，有的品种收集固形物（如菌丝体或细胞），无论收集液体或固体发酵后都要进行固液分离。

常采用的方式有离心分离、板框过滤、碟式过滤器及膜分离等几种。

可根据发酵液的物理性状，如黏度、固含量、菌丝体的形态来选择一项合适的分离方式。

分离后需进行贮存，选择合适的收集罐，把分离后的清夜或细胞收集贮藏，备下工序提取纯化使用。

3生物发酵系统工程设备URS文件要点

3.1发酵工艺流程和主设备的URS要点

3.1.1工艺流程

生物发酵系统无论项目大小，其工艺流程均要描述清楚，是采用单级（单罐），还是采用多级（二级、三级发酵）。

一般视发酵品种，生产规模大小而定。

单级（单罐）常用在小规模的项目，多级发酵指的是常被采用的三级发酵（见图2所示）。

发酵工艺流程确定后再对主体设备（发酵罐）进行技术要求的描述。

3.1.2.发酵罐（生物培养器）的构成及技术要求

首先根据项目的生产规模列出发酵系统所需用的发酵罐的规格大小及数量。

3.1.2.1可用下列表格形式明确标示出来：

名称

物料

工作容积

全容积

台数

说明

一级种子培养罐

二级种子培养罐

三级生产发酵罐

配料罐

收获罐

3.1.2.2发酵罐（种子罐与生产罐）本体

发酵罐又被称为生物反应器，或生物培养罐。

先定罐体的规格大小，如有效工作容积、全容积、最小工作容积、径高比例（常用2：

1～3：

1）、工作环境（如温度、湿度、电源配置）、罐内工作状况、工作温度（常用35℃～37℃）、灭菌温度（121℃，30分钟）、最高设计温度（135℃）、设计压力（0.30～0.40MPa）、材质（本体316L、夹套及外保温层304）等。

加工制造规范为中国压力容器规范。

此外，还有与发酵罐相关联的工艺管接口种类与方位。

（1）发酵罐上封头工艺管接口。

常有人/手孔、搅拌器口、压力表口、灯视镜、CIP接口、排气口、液位计探头、压力探头、泡沫剂加入口、进料/补料口以及灭菌蒸汽口等；

（2）发酵罐筒身工艺管接口。

常有取样口、检测口（pH、DO、T、浊度等）、混合气体加入口以及条型视镜等；

（3）筒体夹套（如整体夹套、半管夹套、蜂窝夹套）接口。

常有加热蒸汽/热水入口、冷却水出口、加热蒸汽出口/冷却水进口；

（4）发酵罐下封头工艺管接口，搅拌机口（下搅拌用）出料口；

（5）发酵罐内附件，如挡流板（或冷却蛇管）、空气分布器、喷淋球；

（6）发酵罐的操作架台。

3.1.2.3发酵罐的搅拌装置

搅拌装置在发酵罐中起重要作用，在技术文件中应重点描述。

具体有：

搅拌轴及连轴器、轴封（双端面机械密封）、桨叶型式（有效选择）、搅拌功率、搅拌转速以及调节方式等。

此外还有材质与表面处理的要求（Ra≤0.4μm）,特殊要求电抛Ra≤0.3μm。

其桨叶选择见图3。

假若工程项目为动物细胞的话,发酵时宜选择剪切力小的桨叶,避免打碎动物细胞。

有特殊要求的,还可以根据细胞脆弱程度试验设计特殊结构桨叶的搅拌装置,既能使发酵液充分混合均匀,又不打碎动物细胞。

桨叶的层数可以根据发酵罐的大小及发酵工艺对搅拌要求选择单层、双层或三层搅拌装置的调节转速,宜选用变频器进行变频调速,并与控制系统相关联。

3.1.3生物发酵系统工艺参数的检测与控制

3.1.3.1生物发酵的过程控制

在技术文件中对发酵的控制要引入生物发酵系统过程控制的概念，这样可以规避因为设备和管道系统的设计本身的缺陷，以及因为发酵过程中各种因素造成的失误带来的偏差和污染。

生物发酵的过程控制，包括下列几个方面：

（1）物料（培养基、发酵液）输送转移过程的控制；

（2）发酵接种，移种过程的控制；

（3）生物培养过程的控制；

（4）取样阀及管道的灭菌过程的控制；

（5）罐体与管道CIP过程的控制；

（6）罐体与管道SIP过程的控制。

3.1.3.2生物发酵常见的检测控制参数

（1）温度，如发酵罐内培养液的温度（℃）、空罐灭菌时的温度（℃）、排放管末端（最冷点）的温度（℃）等。

控制方式:

测定、显示与记录；

（2）pH值，发酵液pH值的测定、显示、记录与控制。

调节方式为调节酸碱的加入量；

（3）溶氧（DO），测定、记录与控制。

溶氧与通气流量的关联控制，溶氧与搅拌转速的关联控制；

（4）压力，发酵罐内压力显示、记录与控制。

可用调节发酵罐的排气量来控制罐内压力,隔膜式压力表现场显示,压力传感器进行远程控制；

（5）搅拌转速，由变频器进行调节与控制；

（6）气体（空气、氧气、CO2等）流量的控制、显示、调节和监控；

（7）浊度的测定，以检测罐内细胞浓度；

（8）进料量的调节与控制，如对培养基、补料等流量的控制，可使用流量计、流量传感器和控制系统；

（9）消泡控制，用控制化学消沫剂的加入量进行控制，同时搅拌装置上的消沫桨叶也起消泡作用；

（10）发酵罐内液位控制，液位显示与记录；

（11）自动报警装置。

常用参数指标及控制范围可参见表2。

3.1.3.3生物发酵控制系统的组成

（1）发酵现场控制（又称下位机）

数据显示与控制操作为图解式触摸屏，有中文菜单与界面，用于数据处理。

如：

1）当前数据的现场显示与运行状态的显示；

2）发酵培养曲线的显示；

3）操作功能的切换，人工手动与自动操作的相互切换；

4）T、pH、DO、转速、液位、补料量等的实时记录与控制。

（2）发酵过程的远程控制（又称上位机）

发酵工艺参数的设定、校正与修改，密码授权，数据的贮存，批极的形成，自动打印，越限报警，发酵历史培养曲线的显示与贮存。

对控制系统的要求:

性能先进，运行稳定，模块化组合设计，操作简便，维护方便。

（3）发酵控制系统的编程（又称软件包）

发酵系统中各工艺过程的数据显示与记录，远程控制接口，中央操作平台，符合GMP

要求的工艺文件管理，操作人员与管理技术人员的授权，可以追踪的工艺参数记录。

网络通讯系统可以自动形成符合要求的发酵生产批板，与其它仪器和部门的连结工作。

3.1.3.4生物发酵项目控制的关键点

（1）搅拌。

搅拌转速的控制，变频调速，并与DO相关联，培养基与生物之间的均匀混合，利用培养可增加产量；

（2）温度。

三个控制关键点。

1）培养温度，按工艺要求进行调节控制；

2）灭菌温度121℃，30分钟；

3）排放管末端温度；

（3）通气。

经过气体分布器进入罐体内，流量控制直接影响发酵液中氧的传送速率与泡沫的形成；

（4）溶氧。

与搅拌、通气相关联，检测与控制发酵液中氧的含量；

（5）pH。

以酸、碱缓冲剂的加入量调节发酵液的pH值；

（6）补料。

各类补料品种的加入流量、方式、时间，控制生物的培养。

生物发酵的控制项目与参数视发酵品种的不同以及培养工艺的不同而发生变化。

3.1.4发酵罐附属部件的选择

调节pH用的酸碱罐及其输送泵，排气过滤器及换热器，消泡剂贮罐及其输送泵，补料液贮罐及其输送泵，夹套加热用的热水罐及泵，夹套冷却用的冷水罐及泵。

3.2生物发酵罐CIP与SIP部分的URS要点

3.2.1发酵系统的CIP工作站

设备的清洗验证也是GMP规范中不可缺少的一环，对生物发酵系统也不例外。

在不拆开或移位的状态下，对发酵罐及其工艺管道使用喷淋球，在一定的温度、压力和时间下，对发酵罐及管道系统的内表面进行喷淋清洗，达到清洗的目的。

常采用设立移动式CIP工作站（对中小型发酵罐）及固定式CIP工作站的方式来完成。

（1）发酵罐中难清洗的部位（见图4）。

发酵罐中难清洗部位，如桨叶部位、档板部分、空气分布器、连轴器、上封头、配管末端等。

（2）常用的清洗方法。

一般先用70～90℃热水清洗，再用10～20%浓度的碱液清洗，最后用纯化水冲洗干净。

对于难清洗的物料或者大型发酵罐，除了在罐顶部安装喷淋球外，还应考虑在罐体的侧面或底部安装喷淋球清洗装置。

（3）一个实用性的CIP工作站的组成：

1）水罐（热水）,夹套加热或换热器加热；

2）酸罐（清洗剂）,夹套加热或换热器加热；

3）碱罐（清洗剂）,夹套加热或换热器加热；

4）纯水罐,夹套加热或换热器加热；

5）管道、泵、阀和切换板；

6）电气自控系统。

用于生物发酵工程上典型CIP工作站（见图5、图6）。

依据发酵系统生产的规模、罐体大小、管道构成等来选择合适的CIP工作站。

3.2.2发酵系统SIP过程

3.2.2.1常用SIP过程（见表2）

3.2.2.2常用SIP控制要求

可进行PLC人机对话界面，触摸屏图示，操作平台,控制参数有：

T、P、时间、电导率、液位、流量、流速等。

3.2.2.3SIP注意点

SIP灭菌后，发酵系统的罐及管道在规定的有效待用时间使用,越时需重新灭菌。

3.3生物发酵辅助系统URS的要点

3.3.1生物发酵系统工程的辅助系统组成

生物发酵系统工程的辅助系统又称为支持系统，主要方面见表3。

4.3.2辅助系统的URS要点

依据生物发酵生产规模的大小选择合适的上面三个辅助系统的材料、用量和指标。

（1）工艺管道系统。

包括管道、管接件、泵、阀等。

按用途分类列表，说明材质、规格大小、数量以及品牌；

（2）工艺用水系统。

计算三种工艺用水的耗用量，以确定管径大小，且描述用水的质量标准。

尤其是纯化水及蒸馏水，应符合相关规范的规定；

（3）工艺用气系统。

在业主提供无油、无水的压缩空气后，可以按不同的用途配置相应的过滤装置，供给发酵系统使用；

（4）许多生物发酵项目涉及生物活性物质的排放，为了不污染环境，凡生物发酵的排放液或放空气体均需灭活处理后，才可以向外排放。

因此，在项目实施过程中必需配置一套灭活装置，可用间歇式灭活罐处理，也可以用连续式灭活装置。

放空向大气排放时应在排放管末端加装0.2μm过滤器。

4其它文件要求

4.1生物发酵系统工程项目竣工文件

发酵系统中各个设备，如种子罐、发酵罐、配料罐、收获罐、灭活罐等。

在安装后均应按中国《钢制压力容器》（150-1998）有关规范，提供全套罐体的竣工资料。

同时，按《机械设备安装工程施工验收通用规范》（50231-1998）所规定的全部安装竣工文件资料。

4.2竣工图纸

（1）各种罐体的设备竣工图；

（2）发酵系统的设备平面布置图；

（3）发酵系统的设备立面布置图；

（4）发酵系统工艺管道的平面布置图；

（5）发酵系统工艺管道的轴侧图；

（6）发酵系统工艺管道的带控制点的工艺流程图；

（7）发酵系统工艺管道的自控原理图；

（8）发酵系统的电气接线图；

（9）各类设备（如泵、过滤器）的结构图；

（10）各类设备（如泵、过滤器）的使用说明书；

（11）CIP工作站管道流程图；

（12）CIP工作站控制原理图；

（13）CIP工作站操作手册；

（14）各类控制、检测文件、零部件的合格证书。

5结语

本文从GMP要求和生物培养工艺的要求两个方面出发，阐述了生物发酵系统设备的URS，从而引申出URS编制要点，供生物发酵工程项目的技术同行参考。

可以说，URS工作是一项涉及面广的系统工程，也是一项科学化、系统化的工作。

如果想指望哪一家设备制造商或工程安装公司来完成生物发酵工程的URS工作是一种不切合实际的想法。

制造商或安装公司只能依据相关规范、法规和业主的URS去制造加工设备和安装，并提供与之相关联的符合要求的技术文件供给业主进行GMP认证工作时使用。

本文改编于：

周立法.生物发酵系统标书技术文件的要点.总31期.2007（11）

周立法，高级工程师，中国制药装备协会专家委员会委员，现九芝堂药业顾问，原上海森松公司顾问