细胞生物实验报告Word格式.docx
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人的静脉外周血(男女各2ml,在校医院添加肝素钠抽取血样)1.1.2实验工具:
恒温培养箱
(1)、电冰箱
(1)、高压灭菌锅
(1)、离心机
(1)、普通光学显微镜(7)、显微摄影的照相机
(1)、培养瓶(4)、离心管(4)、移液枪
(2)、胶头(4)、滴管(4)、烧杯(4)、试管架、插管(5)、试剂瓶(4),载玻片(10)。
1.1.3试剂:
肝素、完全RPMI1640培养粉、秋水仙素、0.075mol/lKCl、植物血球凝集素(PHA)、青霉素、链霉素、小牛血清、秋水仙素、无水酒精、冰醋酸、Giemsa粉末、甘油、甲醇、1/15mol/L的PH为6.8的磷酸缓冲液。
1.2方法1.2.1人体外周血淋巴细胞的培养接种和培养:
在无菌工作台上,打开培养瓶的瓶塞,加入3ml培养基,然后再加入母液为5mg/mLPHA男1女1各加45ul使其终浓度为75ug/ml,男2女2各加50ul使其终末浓度处于83ug/ml,再向每瓶加入0.3mL血液,轻轻摇匀,置37培养箱中培养72h。
培养细胞的秋水仙碱处理:
培养终止前3h4h将新鲜配制的50gmL秋水仙素工作液注入培养瓶中,每瓶40ul使其终浓度为0.6ug/ml,轻轻摇匀,放回培养箱中,继续培养至72h。
1.2.2制片及染色体标本制备低渗及离心:
小心从培养箱取出培养瓶,用吸管将培养后的血细胞混匀,并移至离心管内,以1000rmin离心10min,吸弃上清液,加入8mL37预热的0.075mmolL氯化钾低渗液,用吸管上下吹打约10次,使细胞悬浮于低渗液中,置37水浴箱中,温育20min,使低渗充分。
固定:
低渗终止后,加入新鲜配制的卡诺固定液(甲醇:
冰醋酸3:
1)1mL,预固定2min,打匀,放入离心机内,以1000rmin离心8分钟min,倒掉上清液,继续加入固定液5mL,用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打混合细胞悬液。
室温下静置20min,以1000rmin离心8min,倒掉上清液。
重复固定:
再加入固定液mL,用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打成混合细胞悬液,室温下静置20min,以1000rmin离心8min,倒掉上清液。
制片:
向离心管中加入固定液0.5mL,用吸管轻轻吹打成混合细胞悬液。
滴片时,先用吸管吸取少量细胞悬液以1.8m高的距离滴至事先冰冻的洁净载玻片上,每片23滴,随即对准玻片吹一口气,以协助细胞的分散,然后在乙醇灯火焰上方过火5秒,最后在烘箱中烘干。
染色:
将晾干的玻片标本用Giemsa染液染色20min(用1份Giemsa原液加9份pH6.8的磷酸缓冲液),自来水缓缓冲洗玻片,并烘干,镜检。
结果观察:
取制备好的健康人体染色体标本,先用低倍镜观察,选择染色体分散良好、无重叠的分裂中期细胞,转换油镜下仔细观察分析。
1.2.3染色体组型分析找好的染色体:
在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄并确定数目:
n拍照分剪:
将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。
测量与计算:
将照片上的染色体进行编号,用直尺测量每一染色体的长度,此长度为其绝对长度。
计算每一染色体的相对长度,即每条染色体的长度除以全部染色体的总长度。
测量染色体短臂和长臂的长度,并求出其臂比,即长臂长/短臂长。
将测量的数据记入表相应栏内配对:
根据染色体的相对长度、臂比、次缢痕的有无和位置、形状大小,随体有无,着丝点位置,将其相同表型的染色体从照片上剪下来,将其同源染色体配成对。
排列:
染色体的排列通常是从大到小,按长度顺序编号,等长的染色体,把短臂长的放在前面,具有特殊标记的如具随体的染色体,一般排在最后,性染色体要单独列出。
分类:
以臂比数值确定着丝点位置,据此可将染色体分成五种类型,即正中部着丝点染色体(M)臂比(长/短)1.0。
中部着丝点染色体(m)臂比(长/短)1.0-1.7近中着丝点染色体s(m)臂比(长/短)1.7-3.0近端着丝点染色体(st)臂长(长/短)3.0-7.0端部着丝点染色体(t)臂比(长/短)7.0以上将所得的各项数据填入下列表中组号染色体号相对长度形态大小长臂短臂臂比类型粘贴拍照:
将配对排列好的染色体组型,贴在白卡片纸上,进行拍照,制成染色体组型图。
注:
对于任何一个染色体的基本形态特征来说,重要的参数有以下3个:
相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度100%臂指数=长臂/短臂(反映着丝粒位置的指数)着丝粒指数=短臂/整个染色体长度100%(反映着丝粒位置的指数)人类体细胞的正常核型是含有23对染色体,共46条。
其中22对是男女共有的染色体,一对为男女所不同的性染色体,男XY,女XX。
人类染色体组型群组号染色体号形态大小着丝粒位置随体次缢痕鉴别程度A13最大m无常见1号可鉴定B45次大sm无不易C612+X中等sm无常见9号难鉴定D1315中等st有偶见13号难鉴定E1618较小16m,17m,和18m无常见16号可鉴定F1920小m无不易G2122+Y最小st有,Y无难鉴定2.结果分析用第二组的女生图片做的核型分析我们组在油镜下用相机拍的男生图片和用它做的核型分析女生染色体核型分析数据群组号染色体号相对长度形态大小臂指数着丝粒指数着丝粒位置A17.84%最大1.1247.10%MA26.65%最大0.8842.20%MA35.60%最大1.2444.70%MB45.90%次大2.3330.00%SmB54.55%次大1.5838.70%MC65.60%中等1.2444.70%MC74.70%中等1.4840.60%MC84.85%中等2.330.30%SmC94.25%中等1.934.50%SmC104.10%中等1.1646.40%MC114.40%中等1.540.00%MC123.80%中等1.9234.10%SmCX5.60%中等1.5738.90%MD134.40%中等1.540.20%MD143.60%中等2.529.10%SmD153.40%中等7.512.80%StE163.70%中等tE173.05%中等1.3542.70%ME183.25%中等1.4540.80%MF192.90%小1.540.00%MF202.65%小tG212.40%最小1.3343.70%MG222.10%最小t男生染色体核型分析数据群组号染色体号相对长度形态大小臂指数着丝粒指数着丝粒位置A14.20%最大1.270.442MA23.80%最大1.290.436MA33.00%最大1.140.167MB43.30%次大1.420.412MB53.30%次大2.40.294SmC62.40%中等20.033SmC72.40%中等1.40.417MCX2.10%中等1.120.455MC82.10%中等1.750.364SmC92.40%中等20.333SmC102.40%中等20.333SmC112.10%中等2.670.273SmC122.40%中等1.40.417MD131.70%中等3.50.222StD142.40%中等40.2StD151.70%中等3.50.222StE161.60%中等1.660.375ME171.60%中等1.660.375ME181.40%中等1.330.429MF191.20%小20.333SmF201.40%小2.50.286SmG211.10%最小30.266SmG221.00%最小1.50.4mGY0.80%最小30.25Sm结果分析:
人体正常细胞核型含46条染色体,相互配对成23对。
其中22对为男女共有的常染色体。
另一对男生为XY,女生为XX是男女所独有的决定性别的性染色体。
第一次我们班集体失败的原因可能是在医院采学的时候加的是EDTA而不是肝素使得PHA的作用没能表现出来,也可能是第一次老师给的PHA效价本来就不高。
而第二次实验时,细胞培养过程中每个培养瓶中均出现血细胞凝集现象,定期的摇动可以将其分散。
但制片后效果不是很好,我们组男生装片的细胞数量比较少,这可能是我们组有一个同学在收集细胞第一次离心后倒上清液时把底层细胞也给倒掉了。
而我们女生组有一张装片是制得很好,细胞和分裂相也比较多的,但最后片子找不到了,所以以后有什么实验大家一定要注意保管好自己的材料。
而另外两三张不好的片子中有的没有细胞只有一些蓝色斑块,可能是大家在滴液的时候没有滴到了较边缘位置,然后同学吹的时候又没注意力度和方向使得上面存在的细胞不多然后洗的时候片子又没洗干净。
而对于最后的对于染色体的分布配对的数据可以看出,有的我们分析得到的数据跟理论值是有偏差的,这主要是因为在配对时由于染色体并不都以比较直的形态正对我们,而出现我们测量时的长度不够准确,还有就是染色体不够清晰,其着丝粒不是太容易找准确包括染色体的长度测量也都比较模糊,本次实验的随体等更是不容易观察,而本来有的染色体就不易区分,这就造成了我们结果的不准确性。
3.讨论人体血液中的淋巴细胞是一种分化细胞,它的细胞质很少,RNA和蛋白质的合成速度也很慢,以致很难进行分裂,通常情况下它们都处于间期的Gl期Go或期,故在未经培养的外周血中很难见到正在分裂的淋巴细胞,但是在PHA的刺激下处于Go期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞,重新进入细胞周期进行有丝分裂。
培养基中PHA使用量的过多或过少,将直接影响实验中收获的有丝分裂期的细胞量。
在使用前应进行进行定量测试,仅凭经验按常规量加入PHA,将导致实验结果不一致,分裂相多少相差很大,直接影响实验课效果【3】。
导致细胞培养失败的原因很多,但在培养条件相对恒定的环境中主要因素是抗生素类药物的干扰其可能对淋巴细胞的转化产生抑制作用。
培养中出现凝血和溶血与培养液的PH值PHA和血中的肝素等的抗凝剂有关,凝血和溶血对细胞培养有一定影响但也有培养成功的所以不要放弃培养。
抗凝血剂的选择也很重要,应选能被直接用于人体静脉注射的最好,比如肝素或者肝素钠,而EDTA为金属离子螯合剂对淋巴细胞有一定毒性对温度对细胞培养也是很重要的。
秋水仙素是纺锤体的抑制剂,如果秋水仙素的使用浓度过高或使用时间过长,虽然得到的细胞分裂相很多但是染色体过于的浓缩,若溶度过低或者处理时间过少则分裂相少。
离心时收集细胞般离心速度是1000rmin低渗后细胞膨胀若离心速度过大会提前破裂,染色体丢失严重影响细胞计数和染色体核型分析【4】。
用于显微分离的染色体标本制备方法与常规制片基本相同,只是固定液中酸的比率要适当降低,以减少酸对DNA的破坏,宋文芹在制片中用70%酒精取代了传统的固定液。
为使细胞质背景清楚,崔丽华等采用去壁低渗法,提高了染色体分离的效率。
但无论用什么方法,都要使染色体尽量散开,易于识别目标染色体【6】。
核型是根据细胞分裂中期浓缩的染色体形态结构建立的,核型模式图通常是将显微拍摄的染色体照片剪贴、整理、绘制而成。
不同的物种具有不同的核型,因此核型是区别物种的基本遗传学依据,也对分子生物学的研究具有指导意义。
对于核型分析现在并不停留在染色体形态分析时期,随着科学技术的发展出现了显带技术。
显带技术主要包括荧光显带技术和Gimesa显带技术。
1968年T.Q.Casperson发明了Q-带技术。
1971年,Arrighi发明了Gimesa显带技术。
在对染色体测量和分析上也有一些新技术出现,如有的学者开始使用Photoshop等软件对染色体图片进行处理,利用计算机的软件大大减少了工作难度,并且提高了精确率。
近年来,人类染色体的荧光显带技术获得了飞速发展,ThomaRied等发明了一种光谱成像技术,称为FISH技术【3】。
我认为进行本次实验最重要的是学习细胞培养过程中使用的药品和各个步骤中涉及的原理以及相关操作。
本次自主实验能够让我们很好的把已经学到的一些理论知识和实际相结合起来,结合自己查阅资料能够使我们在一定程度上利用已有知识分析和解决实验中遇到的一些问题。
不过因为平时所养成的一些不好习惯使我们这次实验进行的不是特别顺利,但我们还是懂得了任何一项研究都是需要花大量功夫的。
而理论科学大都又是随着科学技术发展而发展的,所以我们也非常有必要掌握好相关技术操作,比如简单的油镜使用和实验中要用到的相机拍照等。
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5739-5742【3】孔庆友,孙媛,王茜,张开立.人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验的改进【N】.大连医科大学学报,2001,23(3)
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70-75
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