慢病毒生产及使用操作手册文档格式.docx
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(二)传293T细胞
将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净,加入2mL4度冰箱取出的0.25%胰酶,使其均匀覆盖瓶底,置于37度培养箱中3-5min,取出,摇晃可发现细胞于底部脱离,将其全部晃下,加入3mL37度水浴中预热的10%DMEM,移液枪用10mL移液管进行吹打,较大力吹打6-8次即可,不留死角,瓶口处较难吹打可将移液管对准培口,小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。
之后,将所有细胞吸出,置于15mL离心管中,取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中,加入450ul10%DMEM,即为10倍稀释,混匀,取10ul细胞于计数板中计数。
计数板上共4大格,每大格16小格。
计数时,4大格均计数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10倍稀释),即为实际n万/mL细胞浓度。
传代当天记为第一天,若第二天进行转染,铺900-1000万/T75;
若第三天转染,铺350-400万/T75。
每瓶T75加10mL10%DMEM培养基。
转染当天观察细胞密度,80-90%满即可进行转染。
转染前无需换培养基。
(三)做脂转complex
DMEM需在37度水浴中预热,LipoFiterTM转染试剂需恢复至室温方可使用,使用前需摇匀。
转染每瓶T75的complex成分如下:
pspax
10μg
PMD2G
pHBLVTM系列载体
转染后6h换新鲜培液。
注:
LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品,使用说明参考LipoFiterTM说明书。
(四)病毒收集
转染后48和72h分别两次收集病毒上清(24h收集后置换新鲜培液),收集后以0.45μm滤器过滤,于40mL超速离心管中,4℃,72000g/min离心120分钟;
(五)病毒重悬和保存
500ul新鲜培养液重悬病毒沉淀,置于-80度甚至液氮保存。
五、感染目的细胞
(一)细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24孔板,使细胞浓度为1×
105/ml细胞,接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。
(二)病毒感染
1.polybrene的选择:
Polybrene:
是带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细胞的感染效率,通常加入polybrene能提高感染效率2~10倍。
Polybrene有一定的细胞毒性,有的细胞对polybrene的毒理反应明显,因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索;
不同细胞对polybrene的敏感度不同,可以用1~10μg/ml的范围筛选合适的浓度,以24h内细胞无明显毒性反应为佳,可参考文献并进行预实验摸索,polybrene最常用的工作浓度为6~8μg/ml。
1)汉恒生物的自产的Polybrene产品,用户可用以进行辅助感染。
提供的Polybrene母液保存在-20℃(可保存1年以上),避免反复冻融3次以上,否则活性受影响。
4℃可保存2周。
2)Polybrene预实验请先以对照病毒进行摸索,部分细胞系MOI及Polybrene的使用参见附表2。
2.感染细胞最佳MOI的测定
MOI(MultiplicityofInfection,感染复数)是指每个细胞感染的病毒数,通常MOI越高,病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞,比如Hela、293细胞,MOI=1~3时,80%以上的细胞均表达目的基因。
而对于非分裂细胞,比如原代细胞,感染效率较低。
需要进行MOI梯度摸索实验,选择适合的MOI进行实验。
3.感染步骤
按实验需要将细胞铺板(比如12孔板)。
细胞数以第2天密度约50%为宜。
37℃培养过夜。
对于Polybrene可施加的细胞:
准备完全培养基和Polybrene混合物,Polybrene终浓度为摸索得到的最适终浓度。
移去培养基并添加0.5mlPolybrene/培养基混合物于每孔中(适用于24孔板,其他孔板请相应调整体积。
)
对于不适用Polybrene的细胞,以上步骤省略,直接进入下面步骤。
感染前,从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒,吸去细胞原有培养基,加入1/2体积新鲜培养基,再将病毒原液加入细胞中,轻轻8字混匀。
(具体加入的病毒数可参考附表1)37℃小体积感染4小时,4小时后补齐培养基至正常体积。
(感染时培养基体积表格如下)
病毒小培养体积感染表
培养皿类型
表面积/cm2
对应细胞培养液体积
病毒感染对应细胞培养液体积
96-well
0.3cm2
100ul
50ul
24-well
2cm2
500ul
250ul
12-well
4cm2
1ml
6-well
10cm2
2ml
60mm
20cm2
4ml
100mm
60cm2
10ml
5ml
慢病毒感染4小时后补足至培养体积,感染24小时后换液,腺病毒感染2小时后直接换液
感染后第二天(约24小时),吸去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液,继续37℃培养。
感染后48小时,对于带GFP报告基因的病毒,可通过荧光显微镜观测GFP表达效率,对于携带Puromycin抗性基因的病毒,换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液,筛选稳定转导的细胞株(详见下方)。
注意:
溶化的shRNA慢病毒颗粒置于冰上。
反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
4.Puromycin抗性筛选:
Puromycin标准的施加终浓度范围为1~10μg/ml,不同细胞puromycin的工作浓度不同,请查找相关文献(部分细胞参考用量见下图),另外请设不感染筛选对照(未经过病毒感染的野生型细胞),加入等量等浓度的puromycin。
部分细胞puromycin参考值
Cellline
Species
Puromycin(µ
g/ml)
293
Human
3
HeLa
B16
Mouse
1-3
PC1.0
Hamster
10
MC3T3-E1
H9C2
Rat
1
MCF-7
MDA-MB-×
×
HepG2
2
HT1080
A549
1.5
H1299
Humanembroyonicstemcells(HumanESCs)
更多Puromycin使用浓度更新中,详情请参考公司网站……
每2-3天换含puromycin的完全培养液一次,至不感染筛选对照组细胞被puromycin杀光,可进行以下两步操作(依照具体实验需要选择)。
不挑取单克隆:
将感染并筛选后的细胞进行传代,并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。
连续筛选并传3代后,冻存保重稳定细胞株。
挑取单克隆:
将感染并筛选后的细胞挑选至少5个克隆进行细胞扩增,,并继续施加puromycin进行维持性筛选培养。
扩增完毕后westernblot或者QPCR检测目的蛋白的表达。
挑取表达适中的稳定细胞株,连续筛选并传3代后,冻存保重稳定细胞株。
5.感染悬浮细胞
上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法,若是悬浮或半悬浮细胞,则需要通过平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养皿后,封好口,放入平角离心机后,低速(500g-1000g/min)离心1h,然后放入培养箱中正常培养即可。
若由于实验条件有限,没有平角离心机,可用离心管代替,将细胞吹打吸入离心管中,进行低速离心,去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液,室温放置15min(不能超过半小时),然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。
6.对于极难感染的细胞
对于极难感染的细胞,如DC(树突状细胞)等,可采用多次感染的方法,即感染24小时后,更换新鲜病毒进行二次感染,可显著提升感染效率。
附1:
汉恒生物慢病毒质粒图谱
过表达
1.单标记
2.双标记
IRES载体
慢病毒过表达载体,ZSGreen/puro标记
T2A系列载体:
ZsGreen-T2A-PuroRFP-T2A-Puro
Luc-T2A-PuroZsGreen-T2A-Luc
RFP-T2A-luc
干扰
IRES系列载体
慢病毒shRNA干扰载体,ZSGreen/puro标记
特殊用途
用于融合蛋白构建慢病毒载体启动子替换
Tet-onsystem慢病毒载体:
单病毒系统,无须另外表达rtTA,出毒率低,只做建系用,无法提供病毒
Tet-on过表达系统,目的基因插入MCS区,只在DOX存在下才表达,puro可持续表达,用于筛选
Tet-on干扰系统,应用mir30的sh-mir结构,与tuboRFP融合表达,加DOX时RFP和sh-mir结构启动表达,因此会看到加Dox后24小时有荧光出现;
puro为持续表达,用于筛选
sh-mir合成非常贵
附2:
慢病毒滴度测定方法简介:
1、细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1x105/ml,加入96孔板,100ul/孔,为每个病毒准备6个孔。
放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
2、加病毒
第二天,在EP管中做3倍梯度稀释,连续6个稀释度。
稀释方法如下:
每种病毒准备6个1.5mlEP管,每管加入90ul培养液,往第一个管中加入10ul病毒原液,混匀后,吸取10ul加入第二个管混匀。
以此类推,做十个稀释度(10~3*10-3)。
3、追加培养液
第三天,吸去带有病毒的培养液,在每个孔中再加入100ul完全培养液,以利于细胞的生长。
4、观察结果并计算滴度
第五天,在荧光显微镜下观察结果。
滴度(PFU/ml)=细胞数*荧光百分比*MOI*病毒稀释倍数*103
附3:
汉恒生物目的细胞慢病毒感染复数(MOI)与体积对应表
规格
大约数目
MOI值
加入病毒数量
慢病毒
MOI摸索时加入的体积梯度/ul
96well
2-5×
104
20-50
0.4-2.5×
106
4-25ul
4;
12;
20
48well
1-2×
105
0.2-1×
107
20-100ul
20;
60;
100
24well
2-3×
0.4-1.5×
40-150ul
40;
120;
200
12well
5×
1-2.5×
100-250ul
100;
300;
500
6well
108
0.2-1ml
200;
600;
1000
35mmdish
60mmdish
2-4×
0.4-2×
0.4-2ml
400;
1200;
2000
100mmdish
6-10×
1.2-5×
1.2-5ml
3600;
6000
150mmdish
109
2-10ml
2000;
6000;
10000
慢病毒滴度以108/ml为准,其他滴度需相应换算;
大约细胞数目是根据80%~100%细胞密度估算而出,具体细胞数请种细胞时进行细胞计数。
1)24板长满了细胞大约有3×
105个细胞。
如果一天后要长到70%(2.1×
105),建议1.2-1.4×
因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长条件,不会达到24小时翻一倍的速度。
其他规格培养可参照此确定相应culture细胞量。
2)MOI值:
MOI是multiplicityofinfection的缩写,中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。
各种细胞的最适MOI值有差别,请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。
附4:
慢病毒MOI感染参数
不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响,MOI值也略有差异,以下数据是在细胞感染效率在85-100%细胞状态良好的情况下获得的,仅供参考。
细胞系名称
细胞描述
MOI值范围
能否添加polybrene
K562
人白血病细胞
20~40
可
Jurkat
人白血病细胞株
50~80
不可
kasumi
10~30
NB4
U937
人单核细胞
THP-1
人单核细胞株
GBC-SD
人胆囊癌细胞株
30~50
H929
人多发性骨髓瘤症细胞系
100~150
人非小细胞性肺癌细胞
1~3
95D
人肺巨细胞癌
2~4
人肺腺癌
SPC-A-1
人肺腺癌细胞
7402
人肝癌细胞
10~15
Hep3B
HepG2
SMMC-7721
Huh-7
人肝癌细胞系
Hela
人宫颈癌细胞株
HOS
人骨肉瘤细胞系
Hep-2
人喉癌细胞株
HL-60
人急性髓系白血病细胞株
>
HT-29
人结肠癌细胞
PKO
SW480
人结肠癌细胞株
DLD-1
人结直肠肿瘤细胞株
SK-OV-3
人卵巢癌细胞株
SHG-44
人脑胶质瘤细胞
U251
人脑胶质母细胞瘤
U87
人脑星型胶质母细胞瘤
293T
人胚肾上皮细胞
HUVEC-2C
人脐静脉血管内皮细胞
PC-3
人前列腺癌细胞
MDA-MB-231
人乳腺癌细胞
人乳腺癌细胞株
Tca8113
人舌鳞状细胞癌
RPE
人视网膜色素上皮细胞
AGS
人胃癌细胞
BGC-823
SGC-7901
MKN-28
人胃癌细胞株
MKN-45
人胃低分化腺癌细胞株
BxPc-3
人胰腺癌细胞
CFPAC-1
Panc-1
HEC-1-B
人子宫内膜癌细胞株
NIH-3T3
小鼠成纤维细胞系
Raw264.7
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞
10~30(感染后分化)
CHO
中国仓鼠卵巢细胞
HSC-T6
大鼠肝星型细胞
C6
大鼠脑胶质瘤细胞
NRK
大鼠肾细胞
附5:
汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较
腺病毒
逆转录病毒
感染方式
直接加入
换液时间
感染后2h
感染后24h
是否需要筛选
不需要,腺病毒感染能力很强
需要筛选获得稳定感染株,慢病毒的感染能力不强
需要筛选获得稳定感染株,逆转录病毒的感染能力不强
观察时间
如带有GFP等荧光标签,24h后可观察到荧光,36h可达到表达高峰,若不带有荧光标签,则需要鉴定
带有GFP等荧光标签,24h后可以观察到表达,36h达到高峰,若不带有荧光标签,则不可直接观察到,需要鉴定
是否需要助转剂
不需要
有时需要,但是根据具体情况操作,因为助转剂,如polybrene,对细胞的伤害比较大,有的细胞可能承受不了
附6:
汉恒生物病毒包装周期表
感染
目的序列获得
3~5天
2~4天
穿梭质粒构建
3~12天
重组表达质粒构建
8~12天
质粒重组
5~10天
慢病毒包装
腺病毒包装
12~15天
病毒浓缩(可选)
1~2天
大量扩增
滴度测定
纯化(可选)
14~21天
目的细胞感染,筛选
14天
过表达/干扰效率验证
3天
时间总计
52~83天
51~82天
37~49天
36~48天
附7:
动物实验对腺病毒和慢病毒的要求及实现方式
是否需要纯化及方法
需要纯化,纯化方法:
CsCl梯度离心
不需要纯化
是否需要浓缩及浓缩方法
纯化之前需要浓缩,PEG8000沉降法
需要浓缩,浓缩方法:
超速离心法或PEG8000沉淀法。
实现方式
注射
附8:
病毒的保存条件与运输条件
保存条件
分装于-80度长久保存;
一周内使用可保存于4度。
忌反复冻融。
六个月后再次使用,需要重新测定病毒滴度。
勿反复冻融。
0运输条件
用普通的冰袋,不可以用干冰运输,因为干冰所造成的CO2气体环境会大大降低缓冲液的pH值,从而极大影响腺病毒在缓冲液中的稳定性。
但如果使用封口严密的西林瓶或安培瓶包装腺病毒,则可以用干冰运输。
先将病毒保存于-80度,然后全程干冰运输
附9:
慢病毒收到后的注意事项
1、慢病毒的储存
用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于4℃保存(尽量一周内用完);
如需长期保存请放置于-80℃。
a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会降低病毒滴度10%);
在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,所以我们前期对病毒进行了分装(100ul/tube),收到
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