阻断肾素血管紧张素系统对糖尿病大鼠肾脏血管紧张素ⅡAT1受体的影响Word文档下载推荐.docx
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[摘要]目的:
研究链脲佐菌素(STZ)诱导的初期糖尿病大鼠肾组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)AT1受体的表达和阻断肾素.血管紧张素系统(RAS)对其的影响。
方式:
糖尿病模型大鼠随机分为伊贝沙坦组、福辛普利组、两药合用组及糖尿病对照组,另设一正常对照组。
采用放射免疫法检测各组血浆AngⅡ水平,免疫组织化学法及Westernblot方式半定量检测肾组织中AT1受体的散布和表达。
结果:
糖尿病大鼠肾组织AT1受体表达较正常大鼠明显减弱,各用药组AT1受体表达较正常对照组明显上调。
结论:
糖尿病时肾脏局部RAS存在活性改变和从头散布。
[关键词]糖尿病肾病;
肾素.血管紧张素系统;
血管紧张素Ⅱ;
受体;
大鼠
糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)的发病机制尚未完全阐明。
多方面研究揭露,肾素.血管紧张素系统(RAS)在DN的发病机制中起着超级重要的作用[1,2]。
一般以为,RAS能够分为循环RAS和局部RAS两个既有区别又紧密联系的部份。
在糖尿病状态下,循环RAS和肾脏局部RAS活性的高低及动态转变等可能是不同乃至是相反的。
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为RAS的最主要组分,其生物活性主要通过其AT1受体发挥作用[3]。
肾脏AT1受体的表达可间接反映局部RAS的活性。
对于糖尿病状态下肾脏局部RAS的调节状况目前尚存很多争议,各研究结果也时有不合。
本研究通过检测AT1受体在糖尿病大鼠肾脏各部位的表达,观察现在局部RAS的活性转变,并探讨通过用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)福辛普利和AngⅡ受体拮抗剂(ARB)伊贝沙坦,阻断RAS后对AT1受体表达的影响。
1材料和方式
实验动物及分组
200~240g雄性SD大鼠,购自并饲养于复旦大学医学院实验动物中心(清洁级环境)。
环境温度维持在(20±
2)℃。
大鼠进食标准饮食,自由饮水。
所有大鼠随机分为5组,每组6只:
糖尿病对照组(diabeticcontrolgroup,DC组),伊贝沙坦组(irbesartangroup,Ⅰ组),福辛普利组(fosinoprilgroup,F组),伊贝沙坦与福辛普利合用组(irbesartanplusfosinoprilgroup,IF组),正常对照组(normalcontrolgroup,NC组)。
糖尿病动物模型制作
除正常对照组大鼠外,其余大鼠按55mg&
kg-1体重一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ,Sigma公司),48h后尾静脉采血,用快速血糖仪[oneTouchⅡ型,强生(中国)有限公司]测定全血血糖,血糖&
gt;
&
L-1同时用尿糖试纸测定尿糖+++~++++者肯定为糖尿病大鼠。
成模后稳固4~5d开始用药干与,伊贝沙坦和福辛普利溶解于磷酸盐缓冲液中制成7mg&
ml-1的溶液(),每日1次灌胃给药,剂量:
伊贝沙坦组和福辛普利组均为40mg&
kg-1&
d-1;
合用组为两药各20mg&
对照组仅给予等量磷酸盐缓冲液灌服。
观察时刻为4周。
整个实验期间不利用胰岛素。
标本制备
实验第4周末,大鼠空肚16h后在3%水合氯醛1ml&
(100g)-1腹腔注射麻醉下行腹主动脉插管,搜集2ml全血,注入预冷的含20μlEDTA的离心管,4℃离心(1500r&
min-1)5min分离血浆。
取1ml血浆,放入另一管已预冷的含有10μl酶抑制剂1和20μl酶抑制剂2(试剂盒中提供)的试管中摇匀,置于-20℃冰箱保留,待测AngⅡ。
其余血标本待作生化检测。
取血毕,经腹主动脉注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗至肾脏转为惨白,分离肾脏,截取厚度2mm左右的一片肾组织置于4%的中性甲醛缓冲液中固定。
其余肾组织于液氮中暂存。
实验方式
血糖测定
由日立7170型全自动生化分析仪测得。
血浆AngⅡ水平测定采用放射免疫法(试剂盒购自中国原子能科学研究院)测定。
免疫组织化学法检测肾脏AT1受体表达
肾组织标本固定48h,石蜡包埋,切成4μm厚切片,常规脱蜡至水,%H2O2.甲醇处置,加一抗1∶100兔抗大鼠AT1抗体(SantaCruz公司),4℃留宿,加二抗.HRP复合物(AntibodyDiagnosticaInc.)于37℃孵育30min,DAB(AntibodyDiagnosticaInc.)显色4min,苏木素复染。
阳性组织呈棕黄色,而阴性部份呈蓝色。
Westernblot法检测肾脏AT1受体蛋白表达
肾组织加入细胞裂解液匀浆,采用改良Lowry法测定蛋白浓度。
取蛋白100μg经8%的凝胶电泳后,转移至硝酸纤维素膜上,7%的脱脂奶粉.PBST溶液室温下封锁1h,洗膜后加入7%的脱脂奶粉.PBST溶液配制的兔抗AT1抗体(SantaCruz公司)4℃留宿,再用HRP标记的二抗进行杂交,最后加入免疫印记化学发光试剂进行显影。
杂交结果于型凝胶成像系统在白光下扫描后用QUANTITYONE软件进行吸光度分析,强度以吸光度与面积的乘积(A×
mm2)来表示。
统计学处置
实验数据以ˉx±
s表示,采用统计软件进行分析,组间比较用方差分析或非参数查验。
2结果
各组血糖、AngⅡ水平的转变
SD大鼠腹腔单剂量注射STZ后观察4周,模型组动物血糖水平明显升高,说明已经成功成立糖尿病动物模型。
各用药组血糖水平与DC组相较无显著性不同,提示在本研究观察期间,各药物干与对糖尿病大鼠的糖代谢无显著影响。
DC组血浆AngⅡ水平较NC组下降但尚未达到统计学不同(P&
),Ⅰ组AngⅡ水平较DC组和NC组别离增高达倍和倍。
F组和IF组较DC组无明显转变。
提示各药物干与对循环AngⅡ的影响是不同的(表1)。
表1各组大鼠血糖、AngⅡ水平转变比较(略)
各组大鼠肾组织AT1受体免疫组织化学结果
如图1所示,在正常大鼠肾脏,AngⅡ的AT1受体主要表达在近端小管、入出球小动脉、系膜区、致密斑等部位。
糖尿病大鼠除近端小管仍有明显表达外,其它部位的染色明显减弱。
各用药组的AT1受体表达明显上调,特别在系膜区、毛细血管脏层上皮细胞、远端小管等部位免疫染色较糖尿病对照组及正常组均显著增强。
各组大鼠肾组织AT1受体Westernblot结果
肾皮质蛋白经10%的胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上,用AT1受体的一抗进行Western杂交后发此刻50000位置出现阳性条带。
光密度扫描后发觉,DC组肾皮质AT1受体表达量明显减少,仅为正常对照的%;
各用药组的AT1受体表达量均显著增加,别离达到正常对照的%(Ⅰ组)、%(F组)和%(IF组),较DC组增加2倍以上,各用药组间无明显不同(图2)。
3讨论
目前,在糖尿病状态下RAS的调节状况尚无定论,但是大量研究结果表明:
ACEIs和ARBs能明显降低蛋白尿,延缓DN的进展[4,5],提示RAS异样在糖尿病发生进展进程中具有重腹地位。
一般以为RAS能够区分为循环RAS和局部RAS两个既有区别又紧密联系的部份。
就循环RAS而言,各个研究结果很不一致。
Hsueh等[6]发觉糖尿病初期血浆肾素活性(PRA)和AngⅡ水平是正常或降低的。
但是,循环RAS可能随糖尿病病程的不同时期而有所转变。
Kikkawa等[7]报导,PRA和AngⅡ在STZ注射后1~2周的糖尿病大鼠中明显升高,而在4~8周时明显降低。
本研究表明,STZ诱导的糖尿病大鼠模型在4周末血浆AngⅡ水平略低于正常对照组,与Kikkawa等[7]的结果一致。
但必需指出的是,循环RAS的转变并非与肾脏局部RAS的改变相一致。
换言之,肾脏局部RAS的调节可能是相对独立的,并非依赖于血浆RAS的转变。
功能性、免疫组织化学及mRNA研究均支持一个完整的肾内RAS的存在,而且AngⅡ在肾小球滤液、近端小管液、出球小动脉血浆及间质液的浓度均超出循环血浆中的水平。
糖尿病状态下(虽然现在并无系统RAS的激活)应用ACEI所引发的猛烈的肾内反映一样提示肾内RAS是活跃的。
Anderson等[5]发觉,在糖尿病大鼠肾脏存在着ACE活性改变和从头散布,虽然全肾的ACE活性略有下降,但肾小球及肾内血管系统的ACE活性是增加的,同时小管.间质的ACE活性是下降的。
另外,Cheng等[8]发觉,AngⅡ刺激对糖尿病肾脏不同组分AT1受体的影响是不同的,即AngⅡ刺激能够下调肾小球的AT1受体表达(负反馈抑制),但上调近端小管的AT1受体(正反馈)。
本研究对AT1受体的免疫组织化学和Westernblot分析证明,糖尿病大鼠的AT1受体在肾小球、小动脉、小管的表达均明显下调,反过来也支持上述观点,即糖尿病状态下肾脏局部存在着RAS活性的转变和从头散布,专门是肾小球和肾内血管的RAS处于活跃状态,与Cheng等[8]的结论一致。
因此,虽然目前对糖尿病状态下肾内RAS的转变还有必然争议,但多数观点以为,其总的趋势是活跃的,引发的AngⅡ增加参与了DN的发生和进展。
目前临床上能够取得的、可阻断RAS的药物有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEIs)和AT1受体拮抗剂(ARBs)两类。
由于对RAS阻断机制的不同,使得这两类药物之间既有联系又有区别。
其不同主要表此刻下列几个方面:
(1)ACEIs使AngⅠ转化为AngⅡ减少,减弱了AngⅡ对肾素的负反馈抑制,从而引发肾素水平的代偿性升高。
而应用ARBs时,由于AngⅡ对球旁器上AT1受体的刺激被阻断,正常的负反馈抑制也被阻断,从而引发肾素和AngⅡ水平均升高[9]。
本研究结果表明,应用ARBs后循环AngⅡ明显升高,表现了这种反馈调节。
(2)ACEIs只能减少ACE依赖性的AngⅡ产生,而ARBs能够从受体水平阻断任何来源的AngⅡ的效应。
由于在很多器官中存在着非ACE途径的AngⅡ产生,因此理论上ARBs对RAS的阻断可能更为完全。
本研究AT1受体免疫组织化学和Westernblot结果显示,各用药组大鼠肾组织AT1受体的表达较DC和NC组明显上调,但各用药组间并无显著性不同。
一方面提示ACEIs和ARBs对肾脏局部RAS的阻断减少了AngⅡ对其AT1受体的刺激,从而引发AT1受体的代偿性表达上调;
另一方面也提示各用药组对RAS阻断的效果是相似的,并无观察到ARBs较ACEIs对RAS有更强的阻断效果。
一个可能的解释是:
与心肌等组织不同的是,肾脏内AngⅡ的生成以血管紧张素转换酶途径(ACE途径)为主,旁路的非ACE途径则较为次要[10],因此ACEIs对肾脏RAS的阻断可能已接近完全。
总之,本研究证明,在初期糖尿病肾组织中存在AngⅡAT1受体散布和表达的异样,提示糖尿病时肾脏局部RAS存在活性改变和从头散布。
应用ARBs和ACEIs后均引发其AT1受体的幅度相似的代偿性上调,提示二者对肾脏局部RAS的阻断程度也是相似的。
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- 阻断 血管 紧张 系统 糖尿病 大鼠 肾脏 AT1 受体 影响