实用文档SN016992出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Word格式.docx

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3.2　煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。

3.3EC肉汤。

3.4　伊红美蓝琼脂（EMB）。

3.5　营养琼脂斜面。

3.6　色氨酸肉汤。

3.7MR-VP培养基。

3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。

3.9　结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。

3.10　Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。

3.11生理盐水。

3.12革兰氏染色液。

3.13Kovacs氏靛基质试剂。

3.14甲基红指示剂。

3.15Voges-proskauer（V-P）试剂。

4、样品制备

4.1　以无菌操作取有代表性的样品。

如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。

若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；

非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。

检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。

4.2　不同食品样品匀液的制备

4.2.1　液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1：

10的样品匀液。

4.2.2　固体和半固体食品

　　以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1：

10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。

4.3　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4……。

从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。

5、大肠菌群的测定

5.1　大肠菌群MPN值的测定

5.1.1　对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。

每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤，每管接种1mL。

5.1.2　将接种管置于36±

1℃培养48±

2h。

5.1.3　观察试管的产气情况：

检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。

如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；

如有产气者，则进一步作证实试验。

5.2　大肠菌群的证实试验

5.2.1　将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。

5.2.2　置BGLB肉汤管于36±

5.2.3　记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

5.2.4　结果报告：

按BGLB肉汤产气管数，查MPN表[见附录B（补充件）]报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。

6、粪大肠菌群测定

6.1　用直径为3mm的接种环将所有48±

2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。

6.2　将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±

0.5℃水浴箱内，培养24±

水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。

应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

6.3　记录EC肉汤管的产气情况。

产气管为粪大肠菌群试验阳性；

不产气管为粪大肠菌群试验阴性。

6.4 

结果报告：

按产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。

靛基质

MR

VP

枸椽酸盐

鉴定（型别）

＋

－

典型大肠杆菌

非典型大肠杆菌

典型中间型

非典型中间型

典型产气肠杆菌

非典型产气肠杆菌

7、大肠杆菌测定

7.1　将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±

1℃培养24±

7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

7.3　如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；

如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。

用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±

1℃培养18～24h。

7.4　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。

7.4.1　色氨酸肉汤：

在36±

2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。

7.4.2MR-VP培养基：

以无菌操作移取培养物1mL至13mm×

100mm试管中，加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。

　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。

如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。

7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤：

于36±

1℃培养96h记录有无生长。

7.4.4LST肉汤：

2h，观察试管中是否产气。

7.4.5　革兰氏染色：

取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。

大肠杆菌为革兰氏阴性。

7.4.6　大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：

　　如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。

7.5　结果报告：

大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为＋＋－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN值。

8、大肠菌群固体培养基测定法

8.1　样品制备同第4章。

8.2　计数

8.2.1　选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。

另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。

8.2.2　将冷至45±

0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）10～15mL倾注于每个平皿中。

小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。

8.2.3　待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。

8.2.4　翻转平板，置于36±

8.2.5　选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。

菌落直径为0.5mm或更大。

8.2.6　证实

8.2.6.1　从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±

1℃培养24h和48h，观察产气情况。

8.2.6.2　将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。

对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。

8.2.7　结果报告

　　经最后证实为阳性（产气，革兰氏阴性杆菌）的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（毫升）样品中大肠菌群数。

　　例：

10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：

100×

6/10×

10-4/g（mL）＝6.0×

105/g（mL）

附　录A培养基和试剂（补充件）

A1　月桂基硫酸盐胰蛋白（胨）（LST）肉汤

　　胰蛋白（胨）或胰酪胨（Trypticase）　　20g

　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　乳糖　　　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾　　　　　　2.75g

　　磷酸二氢钾　　　　　　　2.75g

　　月桂基硫酸钠　　　　　　　　　　　0.1g

　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　1000.0mL

　　将各成分溶解于蒸馏水中。

分装到有倒立发酵管的20mm×

150mm试管中，每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

最终pH6.8±

0.2。

A2　煌绿乳糖胆盐（BGAB）肉汤

　　蛋白胨　　　　　　　　　　　　10.0g

　　乳糖　　　　　　　　　　　　　10.0g

　　牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液　　200.0mL

　　0.1％煌绿水溶液　　　　　　　　13.3mL

　　蒸馏水

　　将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调pH7.4。

再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×

150mm试管（管内有倒立的小发酵管）中，每管10mL。

最终pH7.2±

0.1。

A3EC肉汤

　　胰蛋白（胨）或胰酪（胨）20.0g

　　3号胆盐或混合胆盐　　　　1.5g

　　乳糖　　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾　　　　4.0g

　　磷酸二氢钾　　　　1.5g

　　氯化钠　　　　　　　　　　5.0g

　　蒸馏水　　　　　　　　1000.0mL

　　将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×

150mm试管（管内有倒立的小发酵管），每管8mL。

121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±

A4　伊红美蓝琼脂（EMB）

　　蛋白胨　　　　　　10.0g

　　乳糖　　　　　　　10.0g

　　磷酸氢二钾2.0g

　　琼脂　　　　　　　15.0g

　　伊红γ（水溶性）　　　　　　　　0.4g或2％水溶液20mL

　　美蓝　　　　　　　　　　　0.065g或0.5％水溶液13mL

　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　1000.0mL

　　在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。

分装于三角烧瓶中。

每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。

最终pH7.1±

使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。

A5　营养琼脂斜面

　　牛肉膏　　　　　　　　　　3.0g

　　蛋白胨　　　　　　　　　　5.0g

　　琼脂　　　　　　　　　　　15.0g

　　蒸馏水1000.0mL

　　将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。

分装合适的试管。

最终pH7.3±

灭菌后摆成斜面备用。

A6　色氨酸肉汤

　　胰胨或胰酪胨10.0g

　　加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。

分装试管，每管5mL。

最终pH6.9±

A7MR-VP培养基

　　（胨）胨　　　　　　　　　　　　7.0g

　　葡萄糖　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）　　　　　　　5.0g

　　将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±

A8Koser氏枸椽酸盐肉汤

　　磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·

4H2O）　　　1.5g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g

　　硫酸镁（MgSO4·

7H2O）　　　　　　　0.2g

　　枸椽酸钠（含2H2O）　　　　　　　　　3.0g

　　将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。

最终pH6.7±

A9　结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）

　　蛋白胨　　　　　　　7.0g

　　酵母膏　　　　　　　3.0g

　　乳糖　　　　　　　　　10.0g

　　氯化钠　　　　　　　5.0g

　　胆盐或3号胆盐　　　1.5g

　　中性红　　　　　　　　0.03g

　　结晶紫　　　　　　　　0.002g

　　琼脂15～18g

　　将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至pH7.4±

煮沸2min，将培养基冷至45～50℃倾注平板。

临用时制备，不得超过3h。

A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液

　　贮存液　　磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g

　　蒸馏水500mL

　　将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。

用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。

　　稀释液　　取贮存液1.25mL，

用蒸馏水稀释至1000mL，分装于合适容器后，121℃高压灭菌15min。

A11生理盐水

　　氯化钠　　8.5g

　　将氯化钠溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

A12革兰氏染色液

　　结晶紫染色液：

　结晶紫　　1.0g

　　95％乙醇20.0mL　　

1％草酸铵水溶液80.0mL

　　将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

　　革兰氏碘液：

　　碘　　1.0g　

　碘化钾　2.0g　

　蒸馏水300.0mL

将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

沙黄复染液：

　　沙黄　0.25g

　　95％乙醇10.0mL　

　　蒸馏水90.0mL

　　将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

　　染色法

　　a.将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。

　　b.　滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

　　c.滴加95％乙醇脱色约15～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

　　d.　滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。

结果：

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

A13Kovacs氏靛基质试剂

　　对二甲氨基苯甲醛　5.0g

　　戊醇75.0mL　　盐酸（浓）25.0mL

　　将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。

A14甲基红指示剂

　　甲基红0.1g　　

　　95％乙醇300mL

　　将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL。

A15Voges-Proskauer（V-P）试剂

　　甲液　　　

α-萘酚　　5.0g

　　无水乙醇100.0mL　　乙液

　　氢氧化钾40.0g　　用蒸馏水加至100.0mL　

附　录B1g检样中最近似值（MPN）表　　

阳性管数

0.1

0.01

0.001

0

＜3

2

9.1

1

3

14

6

20

9

26

15

6.1

9.2

27

12

34

6.2

21

9.3

28

35

16

42

9.4

29

13

36

44

19

53

3.6

23

7.2

39

11

64

95

73

43

75

120

160

93

150

210

24

290

240

460

1100

>

（补充件）使用三管法，接种量分别为0.1，0.01和0.001g。

注：

①本表采用3个稀释度[0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）]，每个稀释度接种3管。

　②表内所列检样量如改用1g（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）时，表内数字应相应降低10倍；

如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）和0.0001g（mL）时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。

附加说明：

　　本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。

　　本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。

　　本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。

　　本标准主要参考美国公职分析化学家协会（AOAC）法定分析方法第14版第46章（1984年）。

中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准1993-05-01实施