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抗生素糖基转移酶研究进展
抗生素糖基转移酶研究进展
【摘要】糖苷类抗生素是临床上广泛应用的抗菌和抗肿瘤化合物。
该类化合物在体内由糖基转移酶催化,糖基化反应通常在抗生素生物合成的最后发生,糖基的位置、类型和数量对糖苷类抗生素的活性有很大的影响。
本文综述了糖基转移酶的种类、功能、特性及其在组合生物合成中的应用与研究前景。
【关键词】抗生素的糖基转移酶抗生素糖苷糖基化
Recentadvancesinantibioticglycosyltransferases
ABSTRACTGlycosideantibiotics,acategoryofcompoundswidelyusedclinicallyforantibacterialandanticancer,arecatalyzedbyantibioticglycosyltransferases(Gtfs)invivo.ThesugarmoietiesaretransferredtothecorrespondingaglyconbyGtfs,oftenworkatverylatestagesofbiosynthesisofantibiotics.Theposition,typeandnumberofsugarmoietiesincorporatedtotheantibioticshavegreatimpactonitsbioactivity.Thisarticleprovidesanoverviewofthecategories,functions,characteristicsofGtfs,theirapplicationsincombinatorialbiosynthesis,andtheprospectsforresearch.
KEYWORDSAntibioticglycosyltransferase;Glycosideantibiotics;Glycosylation
抗生素糖苷在临床上主要用于抗菌和抗肿瘤,在抗生素生物合成基因簇中已经发现了很多编码糖基转移酶的基因[1],但人们对抗生素糖基转移酶(antibioticglycosyltransferases,Gtfs)的特异性和催化机制了解不多。
糖基与不同配基的结合能大大增加天然产物的结构多样性,在功能上,这些糖组分通常参与目的细胞的分子识别,影响化合物的生物活性[2]。
目前,随着抗生素的广泛使用,耐药菌也在逐年增加,迫切需要寻找新的抗生素来与之抗衡。
通过糖基化增加抗生素种类和改变抗生素活性是一条很有前景的途径,探讨糖苷类抗生素的产生机制和糖基转移酶的催化特征,有望为发现和改造新活性的抗生素奠定基础。
1糖苷类抗生素
很多糖苷类抗生素在生物合成中经过了立体和区域选择性的糖基化,在这一生物反应中,糖基转移酶催化其结构中的糖基以单糖、双糖和寡糖链的形式结合到配基上从而形成特定的C、N和O苷()。
糖苷类抗生素的生物合成途径中,糖基化通常是后修饰的最后一步,如万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)的糖链都是在生物合成的最后引入的[3]。
TheC,NandOglycosideantibiotics
糖苷类抗生素的作用机制主要有两类,一类是通过抑制革兰阳性菌肽聚糖的合成,如雷莫拉宁(ramoplanin)[4];另一类是抑制DNA促旋酶的活性,如新生霉素(novobiocin)[5]。
2糖苷类抗生素中糖基的主要作用
糖基化的作用和意义主要体现在以下三个方面:
第一,增加化合物的水溶性。
己糖衍生物结合到抗生素糖苷配基上,增加了抗生素的亲水性利于药效的发挥,典型的有替考拉宁环七肽上的N乙酰葡萄糖胺(Nacetylglucosamine,GlcNAc)和雷莫拉宁骨架上的甘露糖链;第二,利于分泌。
A40926生物合成途径中的甘露糖基转移酶(mannosyltransferase)特异识别mannosylPPC55作为糖供体,使糖基化的抗生素利于分泌[6]。
第三,糖基化是产生菌的一种自我保护机制。
在竹桃霉素(oleandomycin)的产生过程中,糖基转移酶OleD使中间态抗生素糖基化,造成其在胞内短暂失活,抗生素分泌后,再由糖苷酶水解去除糖基,使其恢复活性[7]。
该机制在大环内酯类抗生素中比较常见,类似功能的酶还有MgtA[8]。
3糖基转移酶
糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子,如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上,糖基化的产物具有很多生物学功能。
在不同的Gtfs家族中存在一类与抗生素生物合成相关的Gtfs,它的功能是在抗生素生物合成的后期使其糖基化,通过糖的位置、类型和数量的改变对抗生素的活性进行调节。
随着对抗生素生物合成基因簇的深入研究,从放线菌中已经分离了100多个抗生素生物合成相关的糖基转移酶基因,序列分析表明这些基因编码的蛋白都属于糖基转移酶家族。
大多数糖基转移酶基因都具有靠近C端的富含甘氨酸(glycinerich)的保守区,该保守区也存在于UDP糖基和UDP葡糖醛酸基转移酶中。
选择GenBank中注册的有代表性119条糖基转移酶序列,用PAUP软件进行系统分析,以近邻法构建系统进化树()。
进化树的分析结果表明,糖基转移酶基因之间亲缘关系的远近,并不能很准确的推断其生物学功能[9],例如,EryCⅢ和MegCⅢ,在氨基酸水平上具有%的一致性,能识别同样的配基,UrdGT1b和UrdGT1c表现出了很高的同源性(具有91%一致的氨基酸和仅在31个氨基酸区域内有几个不同的氨基酸),但是它们却转运不同的己糖,UrdGT1c转移L夹竹桃糖(Lrhodinose),UrdGT1b转移D橄榄糖(Dolivose)[10]。
催化CC、CN与CO糖苷键形成的糖基转移酶,在基因的序列和氨基酸水平上并没有明显的差异,如Asm25(安丝菌素酰胺糖苷生物合成途径中催化CN糖苷形成的Gtfs)[9,11]、UrdGT2(乌达霉素生物合成途径中催化CC糖苷形成的Gtfs)[12]、GtfB(万古霉素生物合成后修饰中催化CO糖苷形成的Gtfs)[13]。
在万古霉素的后修饰过程中,糖基转移酶GtfB的Adendrogramofdifferentantibioticglycosyltransferases功能是将UDP葡萄糖中的葡萄糖基转移到万古霉素的骨架上,对其晶体结构的研究表明,该酶具有两个结构域,存在于中间区域的沟可能包含UDP葡萄糖的结合区域[13]。
糖基转移酶的结构测定将有助于我们深入研究其催化特异性。
Gtfs的两个显着特征是:
第一,在抗生素生物合成过程最后起作用,这一点使其在组合生物合成中能得到灵活的应用,其底物结构特异性的阐明可以为新结构和新功能化合物的发现奠定基础。
Gtfs催化的糖基转移反应中,己糖的C1通过三磷酸核苷的去磷酸来激活,从而在亲电子的C1位置上捕获糖基底物,然后经亲核攻击,与糖苷配基的羟基结合。
第二,大部分的糖基转移酶可以催化活化的己糖结合到糖苷配基底物的羟基上,形成CO糖苷,仅少数例外,如在rebeccamycin[14]和urdamycin[13]的衍生物中存在糖基通过CN和CC键与糖苷配基结合的化合物。
安丝菌素的YMG平板培养发酵物分离得到了安丝菌素酰胺N糖苷类化合物,其结构中的糖基通过酰胺键上的N与糖苷配基骨架相连[11]。
在urdamycin的生物合成中,可能是由于亲核的C原子和酚类的羟基处于邻位导致CC糖苷键的形成[12],但是催化CN和CC形成的糖基转移酶其特异性还没有得到深入的研究。
Gtfs的应用研究
(1)生物体内的研究Gtfs的体内研究主要采用遗传学方法进行,一种方法是通过质粒介导的基因替代宿主菌自身的TDP去氧己糖合成酶基因,筛选到的突变体作细胞工厂用于抗生素的改造。
这些研究包括工程化的daunomycin(道诺霉素)[15]途径用于苦霉素(pikromycin)产生菌和urdamycin的产生菌中生产4′差向异构的糖基和具有不同糖单元的蒽环类抗生素[16,17]。
另外一种方法是在不同的宿主中异位表达Gtfs,这方面的例子包括在宿主中表达oleGII基因产生3Orhamnosyl6DEB、表达tylM2基因产生5Odesosaminyl(tylactone)[18]。
研究表明Gtfs对不同的糖分子具有底物适应性,Salas的研究组创造出了共表达系统,该系统把来源于elloramycin生物合成基因簇中的糖基合成基因盒(Cassette)和糖基转移酶基因elMGT在一起成功地表达[19]。
尽管很多糖基转移酶的底物广谱性已得到了证明,但仍有很多文献还是报道了特异性的糖基转移酶基因的存在,例如,中的UrdGT2[20]和来自NCIMB11891的NovM[21]。
勿庸置疑,随着
应用遗传学方法生产新型聚酮和多肽类化合物日益得到人们的重视,表面上看重组生物合成糖基化的化合物和聚酮、多肽一样复杂,但是和聚酮、多肽合成酶的复杂性相比,由于催化去氧糖产生的酶及其反应机制比较保守,因此重组合成糖基化的化合物更有实践意义[25]。
西班牙的Salas研究组已经建立了成功的基因克隆和表达系统用来生产活化的去氧糖,目的基因处于操纵子的下游,通过启动子的控制可以在链霉菌中表达。
在链霉菌Streptomycesalbus中整合糖基转移酶基因oleGII,导入合成L夹竹桃糖(Loleandrose)的质粒后,合成红霉素内酯B(erythronolideB),而整合糖基转移酶基因elmGT后再导入生物合成L橄榄糖(Lolivose)的质粒pOLV可以成功生产特曲霉素(tetracenomycinC)[26,27]。
Staurosporine(十字孢碱)类化合物的结构是由一个糖分子和一个杂环的吲哚卡唑单元组成,通过化学手段较难得到,通过在一个生物体内共表达rebeccamycin和其它staurosporine类化合物生物合成基因,分离鉴定了大约产生了30种staurosporine类衍生物[28]。
通过遗传学方法改变Gtfs的特异性有一定难度,Salas研究组通过共表达糖基生物合成基因盒、Gtfs基因(staN和staG)和staurosporine的生物合成基因成功地替代了天然附加在吲哚卡唑基团上的糖基,为糖基转移酶在重组生物合成中的应用奠定了基础,证明重组生物合成在生产新的糖基化产物中较药用化学更有利[16]。
使用产生菌作为细胞工厂
用产生糖苷化合物的微生物作为细胞工厂,在基因的编码区通过插入抗生素抗性标记或删除部分基因进行敲除产生突变体,引入外源糖基转移酶基因,使其利用细胞内活化的糖分子和微生物次生代谢的中间体合成新的抗生素。
这种方法已经在很多生产菌株如红霉素(erythromycin)[29]、普卡霉素(plicamycin)、urdamycin、酒霉素(methymycin)[29]和苦霉素(pikromycin)上得到应用[30]。
另外一种促使不同糖单元结合到配基上的策略是在产生类似生物活性化合物的有机体上异源表达Gtfs,宿主作为细胞工厂提供核苷激活的糖源。
配基骨架可以由宿主合成,也可以通过控制宿主的染色体基因和外源基因来合成,或者用化合物进行饲喂。
通过把来源于万古霉素产生菌的基因gtrE在不产生糖基多肽A47934的链霉菌中进行表达,形成了新的糖基A47934衍生物[17]。
Gtfs转运不同的糖到配基骨架的特定C原子上,而用基因工程的方法改变糖在骨架上的位置更有意义,这一设
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