紫外分光光度法测定蛋白质含量Word文档格式.docx
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根据朗伯-比耳定律:
A=εbc,当入射光波长λ及光程b一定时,在一定浓度范围内,有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。
定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标的标准曲线,测出试液的吸光度,就可以由标准曲线查得对应的浓度值,即未知样的含量。
c.仪器组成部件:
各种类型的紫外-可见分光光度计,如下图所示,从总体上来说是由五个部分组成,即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。
2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理:
(1)蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,服从朗伯-比耳定律,因此可作定量分析。
该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。
(2)由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同,所处的微环境也不同,所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。
据初步统计,浓度为1.0
mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间,平均值为1.25+/-0.51。
所以此种方法测量的准确度差一点。
(3)若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质,在280nm处来测量蛋白质含量时,会有较大的干扰。
核酸在260nm处的光吸收比280nm更强,但蛋白质却恰恰相反,因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。
常用下列经验公式计算:
蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260
(A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)
还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量:
蛋白质浓度(mg/mL)=F*
A280*D*1/d
其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值;
d为石英比色皿的厚度(cm);
D为溶液的稀释倍数;
F为校正因子
(4)蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。
其光吸收强度在一定范围与浓度成正比,其波长越短,光吸收越强。
若选用215nm可减少干扰及光散射,用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比,可减少非蛋白质成分引起的误差,因此,对稀溶液中蛋白质浓度测定,可选用215nm和225nm光吸收差法。
常用下列经验公式:
蛋白质浓度(mg/mL)=0.144(A215-A225)
(A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值
三、仪器与试剂
TU-1901紫外-可见分光光度计,比色管(10ml的5个),吸量管、标准蛋白质溶液:
5.00
mg/mL溶液、0.9%
NaCl溶液,待测蛋白质溶液(牛血清白蛋白)。
四、实验步骤
1.基本操作
(1)启动计算机,打开主机电源开关,启动工作站并初始化仪器,预热半小时。
(2)用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL
mg/mL标准蛋白质溶液于5只10
mL
比色管中,用0.9%
NaCl溶液稀释至刻度,摇匀。
用1
cm石英比色皿,以0.9%NaCl溶液为参比(参比溶液不可取出).
(3)在工作界面上选择测量项目为光谱扫描,设置扫描参数(起点:
400nm,终点:
250nm,速度:
中,间隔:
1.0nm,单次扫描)
(4)将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中,进行基线扫描,然后选定量测定,校零,在调回光谱扫描。
2.吸收曲线的制作:
将放在前面的比色皿中溶液换为0.3
mg/mL的蛋白质溶液,点击START进行扫描,得到如下吸收曲线,从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278nm,此波长下的吸光度为0.1984。
3.标准曲线的制作:
在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件(测量波长:
278.00
nm)。
cm石英比色皿,以0.9%NaCl溶液为参比,在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A278,记录所得读数。
4.样品测定:
配制三份待测蛋白质溶液,(取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL
NaCl溶液稀释至刻度)按上述方法测定278
nm处的吸光度。
得吸光度依次为0.3906,0.3765,0.3848。
平均值为A278=0.3840,根据样品溶液的吸光度,从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。
转换后待测蛋白质溶液的浓度为3.0505mg/mL。
六、注意事项
PH最好与标准曲线制作时的PH值一致。
2.在测量前应把机器预热半小时。
3.吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。
4.溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。
5.在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。
6.在实际操作中,比色皿在使用中应注意保持干净,更不能触摸比色皿的光面,以防摩擦影响通光。
七、思考题
1.
紫外分光光度法测定蛋白质的方法有何缺点及优点?
受哪些因素的影响和限制?
答:
优点:
方法操作简便、迅速、不需要复杂和昂贵的设备,不消耗样品,测定后仍能回收使用,低浓度的盐和大多数缓冲溶液不干扰测定。
缺点:
准确度和灵敏度差一点。
干扰物质多:
对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质,有一定的误差。
若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质,会产生较大干扰
2.
若样品中含有核酸类杂质,应如何校正?
因为核酸在260nm处的光吸收比280nm更强,但蛋白质却恰恰相反,因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。
八、实验总结
本次实验总体来说比较成功,实验操作比较规范,无明显失误,未损坏仪器。
同时也让我们学会了操作TU-1901紫外-可见分光光度计,进一步熟练掌握了定量分析及标准曲线法。
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网友评论:
1
网友:
化学爱好者
2007-02-1415:
59
你好厉害啊!
!
不过最后的样品浓度偏差较大!
2
洪润肖
2007-03-1417:
02
我们今天刚做过这个实验阿!
后面的讨论题目就有的写!
!
3
匿名网友
2007-07-1008:
15
厉害啊
培安公司BCEIA2007掀起蛋白质测定技术革命——CEMSprint真蛋白质分析仪真蛋白质含量测定仪(2007-10-2217:
08:
55,新闻来源:
本网)
[关键词:
BCEIA
CEM
蛋白质分析仪
含量测定仪
蛋白质测定
]
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原文转自仪器信息网,否则将追究其法律责任!
近来一段时间以来,在欧盟,日本和美国所发生的一系列针对中国制造的食品、玩具、农产品、电器等出口产品的质量安全事件。
充分说明,在世界贸易趋向全球化的今天,因受到WTO各项协议的制约,西方各国针对中国进口商品制定严格,甚至苛刻的技术标准、卫生安全标准、检验包装、标签等技术性贸易壁垒,成为当今贸易对峙的焦点。
技术性壁垒特有的灵活多变性、隐蔽性和多样性,引发一系列摸黑和制裁中国制造的产品事件的出现,造成中国制造的产品出口商品形象的极大破坏,严重威胁我国国家形象。
对“中国制造=劣质产品”的摸黑是今后美国、欧盟和日本对中国的出口产品进一步打压的理由和借口。
中国质量安全保障体系的可靠性受到严重挑战和考验。
培安公司总经理刘伟先生(中)
为了应对WTO的要求,国家已大力加强质量安全保障体系建设的投资力度,仅2005年仪器行业的进口总额已达138亿美元,不比任何目前西方国家的投入低。
引进的设备用于加强对工业、电子、农业、环境以及科研技术质量监控系统。
尽管如此,质量安全保障体系的问题依然严重,原因是:
1)起步晚、基础差;
2)实验标准不规范;
3)人员经验不足;
4)仪器质量水平参差不齐。
特别是存在采购技术把关的漏洞,部分仪器厂为了商业利益依靠虚假宣传和商业欺诈,使部分劣质仪器堂而皇之的进入质量监管系统,造成体系可靠性的严重隐患。
面临食品质量安全保障体系的可靠性的挑战,培安公司推出了CEMSprintTM真蛋白质分析仪真蛋白质含量测定仪,弥补了传统蛋白质检测方法非蛋白氮(NPN)冒充蛋白质的缺陷。
培安展位
传统上蛋白质的测定一直采用凯氏定氮法。
该法通过氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐,通过氨盐中氮元素的量换算成蛋白质的含量。
凯氏定氮针对有机氮化合物,主要是指蛋白质,aa,核酸,尿素等N3-化合物。
除蛋白质以外的含氮化合物,在凯氏定氮过程中,被同样消化成(NH4)2SO4,造成蛋白值虚高,我们统称这些化合物为非蛋白氮(NPN)。
因此,不法商人通过添加三聚氰胺等添加剂造成虚假蛋白质,不但无法检测出真蛋白质的含量,而且使得伪劣产品蒙混过关。
区别蛋白质与NPN的意义在于可以获得精确的蛋白质含量。
这对需要进行蛋白质检测行业如食品、饲料及蛋白研究领域中具有巨大的利用价值。
CEM
SprintTM真蛋白质分析仪
CEM公司的SprintTM真蛋白质含量测定仪结合生物科学与食品科学技术,进行快速精确的蛋白质测定。
该系统使用蛋白质融合标签技术区分及测量蛋白质含量(而非氮元素),因此你不必为待检样品中添加过量含氮物质或被含氮物质污染所造成的数据失真。
Sprint利用蛋白质融合标签技术直接区分及测定蛋白质。
不被添加物误导
Sprint使用的itap技术直接标明蛋白质中的氨基。
当添加例如小麦面筋蛋白时会产生错误结果。
而凯氏定氮法和Dumas定氮法都无法区分来自不同成分的蛋白质成份。
·
测量蛋白质(真蛋白质)
确定待检样品中的蛋白质成份
适用所有食品的快速分析
无危害化学物质产生
比凯氏更安全更精确的测定结果
AOAC及AACC认可的检测方法
多种选择方案
Sprint在你的实验开始前,有多种实验方案供用户选择。
它使用了完全创新的软件,针对不同样品您可以使用不同的实验方案。
软件操作甚至简单到如同您翻阅通讯录查找朋友的联系方式。
易清洗
目前的蛋白质分析系统需要维护及清洗。
Sprint使用的处理和过滤系统,包括样品完全分析,所有过程都由Sprint自动清洗。
Sprint的所有无毒样品分析中的过滤器及样品杯均可以更换处理。
CEMSprintTM真蛋白质分析仪真蛋白质含量测定仪
真蛋白质检测的应用
1.食品行业
监控食品加工过程中的所有流程节点,包括原料采购、浓缩、勾兑、干燥、储存等。
如假劣奶粉的危害就在于产品未达到国家蛋白标准限定,但在“国标”的凯氏定氮法检测后通过检测,其原因就在于搀加大量的NPN,造成蛋白质含量虚高。
所添加的NPN大部分是化工产品,严重威胁食品安全。
2.饲料行业
饲料行业同样面临NPN造成的危害。
例如最近引起社会关注的——三聚氢胺。
三聚氢胺含氮量达66%,白色无味,与蛋白粉外观相似,是被不法厂商大量使用的NPN。
与“瘦肉精”、“苏丹红”等少数违禁添加剂一样,损害动物机体健康,并最终通过食物链转移到人体内。
三聚氢胺高温下会形成氰化物,长期或反复接触对肾脏器官形成巨大损害。
3.蛋白研究领域
植物原料中NPN的含量随季节、地域及品种变化很大。
精确检测蛋白质含量,排除NPN干扰对于保证科学研究的严谨性具有重要意义。
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