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论文答辩日期:
2016.06.03
学位授予单位:
目录
摘要III
ABSTRACTIV
前言V
第1章绪论1
1.1分子标记技术类型1
1.2分子标记技术的特点2
1.3分子标记技术的原理和遗传特性2
第2章RFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用3
2.1RFLP标记的原理及特点3
2.2RFLP技术在植物研究中的应用3
2.2.1构建DNA指纹图谱3
2.2.2进行基因定位4
2.2.3鉴定物种多样和亲缘关系4
第3章SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用5
3.1SSR标记的原理5
3.2SSR标记的特点5
3.3SSR标记技术在植物研究中的应用5
3.3.1构建分子遗传连锁图谱6
3.3.2基因定位6
3.3.3亲缘关系和遗传多样性研究6
3.4SSR分子标记技术的优点和不足:
7
3.4.1SSR技术的优点:
3.4.2SSR技术的不足:
第4章SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用8
4.1SNP技术标记的原理8
4.2SNP技术标记的特点8
4.2.1遗传稳定性高8
4.2.2等位基因性8
4.2.3检测速度快9
4.2.4分布广泛,数量丰富9
4.2.5代表性强9
4.3SNP技术在植物研究中的应用10
4.3.1SNP分子标记技术在物种遗传多样性上的应用10
4.3.2SNP分子标记技术种间亲缘关系间的应用10
4.3.3SNP分子标记技术在种植资源关系上的应用11
4.4SNP技术的优点和不足11
4.4.1SNP技术的优点11
4.4.2SNP技术的不足11
第5章AFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用12
5.1AFLP标记的原理12
5.2AFLP标记的特点12
5.3AFLP技术在植物研究中的应用12
5.3.1基因指纹图谱的构建13
5.3.2品种鉴定13
5.4AFLP技术的优点和不足13
5.4.1AFLP技术的优点14
5.4.2AFLP技术的不足14
参考文献15
结论17
致谢18
摘要
分子标记(MolecularMarkers),是在分子水平上把具有遗传性的物质中核苷酸序列的变异作为研究基础的遗传标记方式。
分子标记的数量是庞大到不可预估;
在生物发育的不同时期,来自各个组织中的DNA都可以用分子标记的方法进行分析[1]。
分子标记技术从上世纪首次被发现之后在无数学者锲而不舍的努力研究下,从开始的RAPD.RFLP,到后来的SSR又在SSR的基础上加以改善创造了ISSR,再到后来的AFLPSNP,每一项技术都有它们独特的优势,但也都存在着不足,正是由于每个技术都不是完美的,才需要不断的研究进步。
目前为止分子生物学技术已经发展到十分精确的程度,DNA分子标记技术也以达到几十种,这里主要介绍其中的4种标记方法,包括RFLPSSRSNPAFLP分子标记技术。
分子标记技术广泛应用于动物植物遗传育种基因检测等方面,本文介
绍其在植物学研究中的应用。
关键词:
分子标记;
植物学研究;
DNA序列检测;
RFLP;
SNP;
AFLP;
SSR
ABSTRACT
MolecularMarkersisbasedonthenucleotidesequencevariationofgeneticmaterialamongindividualsgeneticmarker.Thenumberofmolecularmarkersareverylarge.Indifferentstagesofbiologicaldevelopment,DNAofdifferenttissuescanbeusedformarkeranalysis.Withthedevelopmentofmolecularbiologytechnology,DNAmoleculartechnologyhasbeenanumberoftenkinds.Withthedevelopofbiologicaltechnology,wefindsomanymethods.likeRALDRALP,AndSSR,ISSR,Now,weuseAFLP,SNP.Herearethe4mainmethodsofmarking.IncludingRFLPRAPDAFLPSSR.Molecularmarkertechnologyiswidelyusedinplantgeneticsandbreeding,genedetectionandsoon.TheapplicationofitinBotanyisintroducedhere.
Keywords:
molecularmarkers;
Botanicalstudies;
DNAsequencedetection;
SNP;
AFLP;
前言
如今分子生物学的发展十分迅速,分子标记技术也在不断改进中逐渐升级。
DNA的多态性是分子标记的基础,因此具备表现稳定、数量多、多态性高、对目标形状表达无不良影响、部分标记遗传方式为共显性、成本低等特点[2]。
目前已经在植物学动物学遗传学分子生物学作物育种学等领域取得了卓越的成就。
分子标记技术多种多样,在不同领域根据不同样本采用的技术也不同,在本篇论文中主要介绍分子标记技术在植物学领域的应用,主要介绍其中的4种标记方式。
以及这4种方式如何应用于植物学研究。
我们知道每一种植物都有其特定的DNA,因此自然界中基因数目是十分庞大的,采用分子标记可以将基因分类,这样就节省了很多人力物力。
所以,对分子标记技术进行系统性的研究,并明确其在植物研究中的作用机理是有非常重要的意义。
第1章绪论
1.1分子标记技术类型
按技术特点,分子标记技术可分为3类。
分别是以分子杂交为基础的DNA标记技术主要是RFLP标记[3]。
以PCR反应为基础的各种DNA指纹技术。
PCR技术首创于1985年,由MULLIS等在模板DNA引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应,合成特异DNA片段的一种方法。
PCR反应分为变性复性和延伸3个阶段。
在下文中会详细描述。
第三类是一些新型的分子标记,这里不做详细介绍[3]。
1.2分子标记技术的特点
分子标记是发展较早的遗传标记,它是DNA水平的标记其主要是对发育时期的生物个体、甚至细胞进行检测,在不受环境基因是否表达的限制外,多态性丰富、数量庞大、及操作简便也是其优点,分子标记为植物学研究提供了方便快速的方式,目前已有RFLP,RMAPD,SSR,RAPD,AFLP等分子标记我在这里主要介绍4种标记技术。
RFLP、SSR、SNP和AFLP。
分别介绍其特点
(一)RFLP又叫限制性片段长度多态性标记,它的特点是用放射性同位素或者非放射性物质标记DNA,然后将具有放射性的DNA作为探针与膜上DNA进行杂交,经过放射自显影或酶学检测后即可显示该片段多态性情况。
(二)SSR此项技术的特点是依据其两侧特定的引物进行PCR扩增,技术更全面,因此又称它为基于全基因组DNA扩增其微卫星领域。
(三)SNP是根据单个碱基的突变为基础而提出的。
由于突变的方向各异,所以有突变引发的多态性也相当的高。
因此它的遗传稳定性很强。
现在称它为继RFLP和SSR之后的第三代标记技术。
(四)AFLP这项技术是对限制性酶切片的选择性扩增。
技术更精确,因而又称作基于PCR的RFLP。
1.3分子标记技术的原理和遗传特性
在分子标记技术发展的过程中,AFLPRAPDSSRSRAP等多种新型标记技术在多种植物领域获得成功应用。
与其精确科学的原理是密不可分的。
不同的标记技术应用的
原理各不相同,主要是针对DNA序列进行体外扩增对引物进行筛选,选出多态性高遗传稳定的DNA谱带筛选过后针对这些谱带进行电泳扩增可以扩增出大量谱带再次进行筛选[4]。
各种技术的具体技术原理在下文中进行详细介绍。
在遗传特性方面来说,分子标记技术达到了前所未有的高度,我们知道分子水平是非常精确的,而分子标记是严格利用碱基互补配对原则扩增DNA然后进行十分细致的筛选,因而精确度极高,选定出的DNA谱带也是遗传性状高可以稳定遗传的优良基因。
应用分子标记的遗传稳定性高的特点,已经繁育出品种优良的红麻,大豆,茄子,小麦。
以及DNA图谱的制作。
这项技术目前主要应用于基因定位,构建分子图谱,种质资源分类与遗传多样性研究以及辅助育种等方面[5]。
第2章RFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用
2.1RFLP标记的原理及特点
RFLP分子标记技术是发现最早(上世纪70年代已被发现),也是目前世界上应用范围最广的一项分子标记技术。
1980年首次应用于人类基因连锁图谱的绘制。
目前该技术已经广泛应用于动植物连锁图的构建,重要基因的分子标记及筛选等研究领域。
该项技术的原理是录用植物基因组DNA上碱基缺失、插入、重复、替换,等从而造成限制性内切酶酶切位点的缺失或增加,这种现象导致了限制性片段长度不一,也就是多态性。
这些片段具有特异性,因此它可以作为DNA特有的指纹[6]。
RFLP技术是因为核酸序列不同导致DNA片段之间产生等位基因差异的结果,即由于在限制性切点间的点突变、重排、缺失、等原因从而引起基因型间限制性片段长度发生变异,如果想要检测RFLP,就要在提核DNA后用限制性内切酶酶解,酶解后通过电泳分开,然后再经过转膜,最后,在进行杂交的同时进行自显影。
用RFLP分析方法可显示出两条同源染色体之间特异位点的限制性片段[8]。
在同源染色体上同一位点对应的条带所对应的限制性条带如果相同就会出现一条条带,如果不同就会出现不止一条的条带[8]。
这些等位基因之间的带型的差别就可以代表一个限制性片段长度多态性也就是RFLP.。
如果观察到一个RFLP,则可用检测出这个RFLP的酶探针追踪这个RFLP位点在分离群体中的遗传状况,在整个作图群体中,因为每一个RFLP位点上的等位基因依照孟德尔规律遗传,因此,RFLP标记可用传统的方式来进行遗传分析,把基因位点归入连锁群[6]。
在这些连锁群中,标记间的顺序和遗传距离都能估计出来,所以可以作出一个RFLP的遗传连锁图谱。
若要在RFLP连锁图谱上定位一个特定性状的相关基因。
第一步,要在图谱群体的原来个体中进行准确的测量,然后,寻找性状与RFLP标记位点之间的相关关系。
如果一个性状与它对应的标记紧密相连,这些标记就可以不用等到该片段基因表达之后而事先检测出该基因型是否拥有与所研究性状相关的染色体片段。
简而言之此项技术是以一系列随机排列的碱基顺序的核苷酸单链为引物,以所研究基因组DNA为模板进行PCR扩增,经35至40个循环,产生大量长度不同的多态性DNA片段,扩增产物通过电泳进行分离,再经过染色来检测扩增产物DNA片段的多态性。
因此,RFLP分子标记技术的一个优点就是它可以直接反应同源染色体上的核苷酸碱基序列之间的差异,它的分析过程与基因表达与否没有关系,我们把这种RFLP遗传连锁技术应用称为(MAS)标记辅助筛选技术[7]。
2.2RFLP技术在植物研究中的应用
2.2.1构建DNA指纹图谱
1980年植物学家比斯坦因首次提出分子标记技术可用于建立遗传连锁图谱的设想以来,凯尔乐道易思等利用这一设想的原理成功建立了第一张人的RFLP图谱,目前利用这一技术在植物学领域已建立了多种植物和蔬菜等的RFLP图谱。
RFLP图谱在国内外得到了成功的应用。
(1)1998年,中国农业大学生物学院分子遗传实验室利用RFLP图谱定位了玉米矮生基因的5个QTL位点[7]。
(2)1992年,法拖肯利用RFLP图谱定位了红豆种子重量的QTL位点。
[8]
(3)1988年,彼得森跟据马玲薯的RFLP图谱,定位了控制果实性状的6个QTL位点。
[9]
2.2.2进行基因定位
RFLP分子标记的一大特点就是数量化,数量性状的每个等位基因就是一种多态性基因,而RFLP又是DNA多态性的一种代表量度,因此RFLP技术可用来对数量性状基因进行定位,主要的方法包括:
以标记为基础的分析法和以性状为基础的分析法(TB法)区间作图法。
主要应用于水稻、玉米等作物的研究[9]。
2.2.3鉴定物种多样性和亲缘关系
基因定位和分子图谱的构建更加有利于物种亲缘关系和遗传多样的研究,这样为种质资源的保存、收集、等以及探索物种起源奠定了基石。
第3章SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用
3.1SSR标记的原理
SSR标记又叫微卫星标记。
微卫星DNA分布于整个基因组的不用位置上,其两端的序列多是单方向拷贝序列。
根据这个,设计一对特异引物,在利用PCR技术扩增,在通过电泳分析多态性[10]。
同一类型的微卫星DNA分布十分广泛,它的范围涉及整个基因组的不同位置上,因为每个位点上的折叠形态和重复次数的不同造成多态性各异。
人和动物大多数为TG重复而植物主要为AT重复。
SSR标记重复性好,呈共显性标记,多态性好的特点。
基因组建立SSR标记必须克隆出数量足够的SSR进行测序并设计相应的PCR引物。
3.2SSR标记的特点
SSR两侧特定的引物是进行PCR扩增的原料,这项技术扩增范围很广,它扩增的范围是全基因组DNA。
它检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。
它兼具PCR反应的优点,多态性较高。
3.3SSR标记技术在植物研究中的应用
随着基因学科的发展,大量基因组序列被测定出来,给研究SSR序列的人们提供了丰富的资源。
SSR的分布很广泛涉及到植物整个基因组,包括编码区非编码区。
随着SSR技术的发展,在玉米、高粱、水稻、桑树、花生、人参、黑松、大豆、小麦等基因组的DNA序列中都发现了大量的SSR位点为作物品种的检测鉴别提供了大量的依据。
3.3.1构建分子遗传连锁图谱
遗传图谱又叫连锁图谱。
它表示各标记物种的基因在其染色体上的位置,是进行基因定位、克隆、性状遗传和植物育种等学科的应用基础,为基因组学遗传学以及遗传育种等领域的研究提供理论依据。
具体应用举例:
(1)在水稻研究方面:
Susan等把水稻染色体上的SSR整合到已构建好的RFLP遗传图谱上,完成了SSR构建的水稻遗传图谱[11]。
(2)在大豆研究方面:
Akkage等构建了包括34个SSR标记的大豆遗传图谱。
[11]
(3)在花生研究方面:
Moretzsohn等从433对SSR引物中选出了204个遗传性状稳定、多态性高的引物,绘制出了花生的遗传连锁图,并计算出了每个标记之间的距离。
3.3.2基因定位
基因定位就是将与目的基因紧密连锁的遗传标记进行精确的定位,并确定这些遗传标记在染色体上的具体位置。
具体应用举例:
Blair等发现在水稻中有3个微卫星基因与白叶枯病抗性基因相连锁。
[12]
(2)在玉米研究方面:
Song等通过SSR引物绘制了高油玉米的遗传连锁图。
(3)在玉米研究方面:
王凤格等通过利用SSR标记构建了玉米的遗传连锁图谱,同时进行了玉米的遗传效应分析。
3.3.3亲缘关系和遗传多样性研究
生物遗传多样性是通过基因型控制的,导致的性状差异,以此来维持生物的抗性、繁殖能力及对所处环境变化能否做出适应性调整的能力等进行的研究,从而为生物种质资源的培育、利用等提供理论依据。
(1)在玉米研究方面:
Barcaccia等利用SSR标记对意大利一种玉米品种的种质资源进行了遗传多样性及亲缘关系的分析。
[13]
(2)在甜菜研究方面:
Desplanque等利用SSR标记技术分析后得出了野生甜菜比栽培甜菜具有更丰富的遗传多态性。
(3)在马铃薯研究方面:
王绍鹏等利用四对SSR引物对马铃薯品种进行了多态性分析,总共检测出了144个多态性位点。
3.4SSR分子标记技术的优点和不足:
3.4.1SSR技术的优点:
SSR标记的优点主要有[14]:
(1)SSR技术所扩增出的产物覆盖了整个基因组,数量丰富;
(2)SSR技术扩增产物为共显性遗传,因此可以很好的区分纯合子和杂合子;
(3)SSR技术所需要的DNA数量少,且对DNA质量要求不高;
(4)SSR技术扩增出的产物重复性高,可以通用于各种品种间;
(5)SSR技术实验操作简便,易于学习掌握。
3.4.2SSR技术的不足:
SSR标记技术主要的缺点是它并不具有AFLP技术的在测定前不需要知道基因组序列的优点,当它在基因组未测序的情况下,想要获得微卫星,需要知道序列两端的序列信息,引物要根据微卫星两端的序列设计,因此不易获得[14]。
第4章SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用
前面讲到每个分子标记技术都有各自的遗传多态性差异,多态性越高的技术不仅实用起来更为便利,而且代表着此项技术更为高端更为相关学者所接受。
多态性高自然联想到的关键词为“突变”这也是本章SNP技术的灵魂所在[15]。
以前知道突变是不定向的,但是可以人工诱导,DNA序列中的四种碱基ATGC由于排列不同突变点不同由哪个碱基突变等,这些问题由此引发出基因组的多态性差异之大。
SNP技术就是利用基因组DNA中某个单一碱基发生突变而形成多态性的一项分子标记技术。
4.1SNP技术标记的原理
SNP标记技术在1994年首次在科学杂志上与世人见面,但当时这项技术并不全面,在之后的1996年它才被正是提出并命名。
在98年之后才逐渐发展壮大到如今。
SNP是单核苷酸多态性的缩写,它的原理就是利用基因组DNA单个碱基发生的突变从而引起的高多态性。
假设一个基因组的某个位点上有一个碱基发生突变,就称为一个SNP。
由于SNP分布广泛,几乎在任意一个位点都可以找到数量不同的SNP位点,所以SNP得分布位置分成3类:
编码区SNP(cSNP)非编码区SNP(rSNP)调控区SNP(pSNP)。
其中同义cSNP技术虽然是根据突变为原理的分子技术但它并不影响所翻译出的产物氨基酸的种类,而另一种非同义cSNP则会导致氨基酸变化进而影响蛋白质的合成。
SNP碱基的突变大都是在TC之间。
目前SNP技术在许多领域都发挥着重要作用[16]。
4.2SNP技术标记的特点
4.2.1遗传稳定性高
相比于SSR技术的高多态性,SNP技术的多态性就比较低了,原因是它的突变仅发生在单个碱基之间。
由于多态性不高,所以它的遗传稳定性很高。
4.2.2等位基因性
SNP标记最常见的就是发生在2个等位基因之间,这种特性成为二态性也叫等位基因性(也存在极少部分的发生于3或4个等位基因间)。
因为这种特性,基因频率就比较容易估计。
4.2.3检测速度快
SNP技术的一大优点是通过直接测序便可对比差异,从而避免了其他技术还要测量长度的步骤。
也因此它有着独特的优势,而分子检测技术的高水平发展,推动着SNP技术逐渐走向成熟。
SNP本身从分布上数量上量都很大由很广,现在又研制出通量很高的检测仪器,使得SNP的检测速度很快。
4.2.4分布广泛,数量丰富
在动植物基因组中SNP分布十分广泛。
每1000个碱基对中就会出现一个SNP,整个基因组算下来数据是非常之大的。
4.2.5代表性强
存在一部分的SNP可能使蛋白质的功能发生改变,由此引起的改变有可能导致生物体变异或病变,可以为生物学病理学提供参考依据。
4.3SNP技术在植物研究中的应用
SNP技术由于它自身独特的技术特性和遗传最稳定的优点,受到很多领域的追捧。
由于它是根据基因序列变化产生的多态性,所以它是随着科学测序的精确发展而发展的,由于我国地产丰富,科学发展迅速,对林业农业上的乱砍乱伐严重,许多珍稀物种濒临灭绝,所以利用SNP技术分析物种多样性和鉴定种质资源显得尤为重要。
它可以保护濒危物种的种质资源。
4.3.1SNP分子标记技术在植物遗传多样性分析上的应用
遗传多样性是人们为了研究与保护生物系统而研究的核心之一,遗传多样性具有两种属性:
即广义与狭义。
第一种属性为:
地球上所有的生物所携带的遗传信息的总和,这个概念称为广义的遗传多样性。
另一种属性是:
遗传多样性指的是物种内的遗传多样性,即种内一个群体之间或个体之间不同个体的遗传变异的总和,这个概念称之为狭义的遗传多样性。
这里相关学者总结出:
一个物种的遗传多样性越高,对外界环境变化的适应能力就越强,遗传变异就越丰富,这种情况就说明物种生存繁衍的能力越强[17]。
这里列举5个著名的利用SNP技术对不同植物的研究[18]:
在油菜研究方面:
吴金锋等对甘蓝型油菜进行了SNP和SSR遗传多样性的分析,
(1)他挑选出了能够进行种植资源结构分析的SNP位点和SSR位点,再进行SNP分析,结果成功地把所测群体分为3个生态类型;
(2)在葡萄研究方面:
荷兰科学家撒摸索等在葡萄上利用SNP对葡萄基因组进行了研究,对葡萄做了遗传多样性方面的评价。
(3)在柑橘果树研究方面:
魏召新对柑橘和其近缘亲属植物进行了SNP筛选,通过对筛选后的谱带进行聚类分析,将柑橘类果树分成五个类群。
(4)在枇杷研究方面:
王俊等对枇杷的两个品种进行了SNP分析,发现不同品种之间存在较丰富的遗传多样性,利用筛选出的SNP标记进行了遗传多样性的分析。
(5)在茶方面的应用:
张成才等对茶树基因组进行了SNP标记,成功地将3个变种中分离出17份材料,并研究了遗传多样性。
4.3.2SNP分子标记技术种间亲缘关系间的应用
SNP分子标记技术能够用于种间亲缘关系的分析,这对植物学进行遗传育种和品种鉴定分类具有十分重要的意义。
下面举出了SNP技术在2个领域中的应用[19]:
(1)在大麦研究方面:
孔塔等分析了大麦品种7个基因型的一百多个位点,结果发现了72个SNP标记点,这些标记点均能应用于亲缘关系的研究。
(2)在荔枝研究方面:
孙清明将他们自己研发的SNP和SSR等2种分子技术应用于品种鉴定,结果发现御金球这一种全新的荔枝种。
并对这一全新的品种进行了亲缘关系的鉴定,首次向人们展示了这一全新的荔枝品种。
4.3.3SNP分子标记技术在种质资源关系上的应用
SNP分子标记技术在种质资源的分类和鉴定中也发挥着十分重要的利用价值,有助于加快培育新的品种。
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