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你能够加大上样量,没有问题,还有转移时你能够用减少电流延伸时间,多加5
-10%甲醇。
F.想分其余蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分别胶浓度多大适合?
积层胶的
浓度又该用多少?
这么大分子量的蛋白简单作
WesternBlot
吗?
260kd的蛋白不好做,
分别胶用
6%,
StackingGel3.5
%。
G.假如上样量超载,要用什么方法来增添上样量?
假如需要加大上样量使本来弱的条带能看清楚。
能够浓缩样品,也能够依据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地,
超载30%是不会有问题的。
假如已经超了许多了,并且小分子量的也要,能够考虑加大胶的厚度,能够试一试1.5mm的comb。
H.蛋白变性后能够寄存多久?
-80℃,一两年没有问题。
最重点两条:
不要被蛋白酶水解掉;
不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
I.我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分别胶应当采纳7.5%,但我所查资料却要求分别胶和浓缩胶均采纳11%的配方,不知为何?
上述您提到的两种凝胶均能够使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带地点。
J.接下来我准备采纳DAB显色技术,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素系统,不知采纳这样的方案后,关闭液能否要作调整,可否再用5%的脱脂奶粉呢?
仿佛有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?
不可以使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA取代应当好一点.
K.还有一问题,一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?
WesternBlot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一
二抗的量和抚养时间都有关系,也与显色时间长短有关。
开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都能够量多一点时间长一点,自然背景也就出来了。
要拿到好的结果,
假如抗体好的话比较简单,抗体不好的话就需要频频地试了,自然有的不适合WesternBlot的如何做也不可以。
所以拿到好的结果不简单。
L.做组织样品的western的时候,办理样品有什么窍门吗?
还有,您用过大牛血清做
关闭剂吗?
浓度如何?
成效是不是比BSA好一点?
一定进行研磨、匀浆、超声办理,蛋白质溶解度会更
好,离心要充足,膜蛋白
需用更强烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。
还有一点就是组
织中的蛋白酶活性更强,需要注意克制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶克制剂
cocktail),关闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。
假如一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不
错的选择。
M.您能否能够介绍一下大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?
做200kd蛋白的WesternBlot时要注意,分别胶最好选择>
7%的;
剥胶时要当心;
转移时间需要相应延伸;
要做分子量参照(不然出现杂带不知道如何剖析)。
N.有什么方法能够提升上样量?
能够浓缩样品;
增大上样体积来增大上样量。
O.我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白,膜蛋白提取可不可以够不用到超
42kd
量算不算大?
如是需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),能够用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白,用这个做WesternBlot就能够了。
假如是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心计。
42kd不算大,也不算小,所以,能够依据一般的转移方法实行。
P.蛋白的上样量有没有什么详细的要求?
上样量要依据实验的要求来定,
假如要求是定量和半定量的
则上
样量要均等,
假如不过要定性,则没有太大的关系,
尽量多上就行了,
但是不要超
2
过0.3μg/mm。
Q.一抗,二抗的比率能否重要?
比较重要,调整好一抗,二抗的比率,能够去掉部分非特异的本底。
3.抗体
R.做细胞信号传导,要做磷酸化某因子WesternBlot,其二抗有何要求?
对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般介绍用HRP标志的二抗。
S.同一企业的此外抗体用这个稀释度做出来成效很好,所以没做预试,怕费时间,用
什么样的稀释度比较好呢?
我用的ELL+plus试剂盒显色。
转膜留宿,一抗孵育也是留宿的,若关闭也留宿的话就要四天才看的到结果了。
不同抗体,即便是同一企业的抗体,其最正确的抗体稀
释度也是不相同的,需要
你实验探索。
我感觉转膜留宿仿佛没有必需吧,转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行
啦,何须浪费时间呢。
至于详细的转膜时间,还要看
你的目的蛋白分子量的大小;
转
膜的设施,是半干式,仍是湿式。
一抗自然能够留宿,假如你想所短
WesternBlot时
间的话,能够增高一抗的孵育温度,我们实验室一般
37度,两小时就足够了;
你能够参
照抗体说明书。
至于一抗和二抗得稀释度,你能够一抗
1:
1500;
二抗1:
20000试一试。
此外建议你洗膜时,多洗几次,最好是在关闭;
一抗和二抗后起码是
5x5min,跑一张好
膜不简单,多尽点心吧,这
样不会浪费你的时间,只会节俭你的时间!
T.免疫组化和WesternBlot
能够用同一种抗体吗?
免疫组化时抗体识其余是未经变性办理的抗原决定簇
(又称表位),有些表位是
线性的,而有的属于构象型;
线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都
含有;
构象型表位因为受蛋白空间构造限制,煮后变性会消逝。
假如你所用的抗体识
其余是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这类抗体可同时用于免疫组化
和Western,而假如抗体辨别构象形表位,则只好用于免疫组化。
一般抗体说明书上都有注明此种抗体识其余氨基酸区间。
(限于单抗)
U.WesternBlot中抗体的重复应用问题
抗体工作溶液一般不主张储藏频频使用,但是如抗体比较宝贵,可频频使用2-3
次。
稀释后应在2-3天内使用,4度保留,防止频频冻融。
4.滤纸、胶和膜的问题
V.NC膜\PVDF膜\尼龙膜如何鉴识?
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种种类;
硝酸纤维素膜是当前应用最广
的一种固相支持物,价钱最廉价;
PVDF膜介于两者之间。
就联合能力而言:
尼龙膜联合
DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2,可联合短至10bp的核酸片段;
硝酸纤维素膜联合
DNA和RNA能力可达80-100μg/cm2,关于200bp的核酸片段联合能力不强;
PVDF膜联合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。
就温度适应性而言:
尼龙膜经烘烤或紫外线照
射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷联合;
硝酸纤维素膜依赖疏水性互相作
用联合
DNA,联合不坚固;
PVDF膜联合坚固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。
就
韧性而
言:
尼龙膜较强;
硝酸纤维素膜较脆,易破裂;
PVDF膜较强。
就重复性而言:
尼龙膜可
频频用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;
硝酸纤维素膜不可以重复
使用;
PVDF膜能够重复使用。
W.在做WesternBlot时,PBDF膜用甲醇浸泡的目的?
PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上边的正电基团,使它更简单跟带负
电的蛋白质联合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
X.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK能够在同一张膜上吗?
能够。
AA.转膜后经丽春红染色的条带,为何大蛋白分子的一端(即点样空的一侧)的转膜好象不是很好,为何?
这是正常的,大分子的蛋白转移的慢,你延伸转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。
BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法,仍是用上样缓冲液?
用上样缓冲液,这样有几个利处,能够提取总蛋白,同时又能够让磷酸化酶失活。
CC.采纳tanksystem有什么讲究?
建议低电压,长时间,(一般tankSystem用衡压好点),如28V14-16hrs。
DD.做HSPWESTEN定量,相同的抗体免疫组化能做出,而WESTEN却不可以?
这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,能否能做WesternBlot和IHC。
EE.膜一般要如何办理?
一般用甲醇泡泡就能够了。
FF.假如是6×
8转印膜,要加多少一抗?
一抗的稀释度是有说明的,依据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。
GG.上下槽缓冲液有何要求,如何才能达到最正确成效。
无要求。
HH.跑电泳的时候配的胶老是“缩”是什么原由呢?
是有的成分不对吗?
没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。
留宿时拿保鲜膜包起来,在里面加
点水保持湿度就能够了。
假如留宿,胶里的水分被蒸发,采纳保鲜膜包上也能够;
也可
能母液(30%聚丙酰胺)有问题,你能够从头配制一份察看;
能够代替的试剂,尽量换
一下,采纳好的试剂,防止找问题麻烦。
脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
II.膜、滤纸、胶大小有何讲究?
假如是用的是半干转,次序为:
阴极-》滤纸-》胶-》膜-》滤纸。
滤纸的长
宽分别比胶小1-2mm,而膜的长宽分别比胶大1-2mm。
绝对禁忌:
上下两层滤纸因为过大而互相接触,这样会短路,电流不会经过胶和滤纸。
JJ.蛋白质的分子量跨度很大,如要分别小21KD,中至66KD,大至170KD,能够一次做好吗?
这么广的散布不好转移,一般建议:
21kd和66kd能够一同转,12%SDS-PAge,湿
转36V,3-5hrs就能够了,能够依据你实验室的经验调理;
170kd用7%SDS-page,
48V10hrs
-16hrs。
KK.不可以很好地将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低怎么样解决?
能够考虑:
转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可
以参照《蛋白质技术手册》
),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增添蛋白质和
NC
膜的联合能力,甲醇能够防备凝胶变形,甲醇
对高分子量蛋白质可延伸转移时间;
移缓冲液加入终浓度
0.1%SDS,也是为了增添转移效率;
用优良的转移膜,或使用小孔
径的
NC膜(0.2微米);
使用戊二醛交联;
低浓度胶,如低至
6%。
太大时还可以够考虑
用琼脂糖胶;
提升转移电压/电流;
增添转移时间。
LL.如何选择最适合的蛋白杂交膜?
蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。
选择质量上层、符合要求、方便合用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。
依据杂交方案、被转移生物大分子的特征以及分子大小等等要素,我们要对症下药,从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜:
硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。
在低离子转移缓冲液的环境下,大多半带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生分水作用而高亲和力的联合在一起,固然这此中的体制还不是十分清楚,但因为硝酸纤维素膜的这个特征,并且易于关闭非特异性联合,进而获得了宽泛的应用。
在非离子型的去污剂作用下,联合
的蛋白还可以够被洗脱下来。
依据被转移的蛋白分子量大小,要选择不同孔径的硝酸纤维
素膜。
因为跟着膜孔径的不停减小,膜对低分子量蛋白的联合就越坚固。
但是膜孔径假如小于0.1mm,蛋白的转移就很难进行了。
所以,我们往常用0.45μm和0.2μm两种
规格的硝酸纤维素膜。
大于20kD的蛋白就能够用0.45μm的膜,小于20kD的蛋白就要
用0.2μm的膜了,假如用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。
从膜的质地上来看,最重要的指标就是单位面积上能够联合的蛋白的量。
硝酸纤维素膜的联合能
力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关,市场上有些硝酸纤维素膜往常会还有大批的醋酸
纤维素,因此降低了蛋白的联合量。
S&
S企业采纳的是100%纯度的硝酸纤维素,保证了
最大的蛋白联合量,可达80-150μg/cm2。
因为100%的纯度,因此也大大减少了非特异性的联合,降低杂交背景,无需高谨慎度的洗脱步骤。
其次,膜的强度和韧性也是需要
考虑的要素。
惯例的硝酸纤维素膜
比较脆,漂洗一两次就会损坏,不可以频频使用。
PVDF转移膜:
PVDF是一种高强度、耐腐化的物质,往常是用来制造水管的。
PVDF膜可
以联合蛋白质,并且能够分别小片段的蛋白质,最先是将它用于蛋白质的序列测定,因
为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解,所以就找寻了
PDVF作为代替品,固然PDVF
膜联合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高,但因为它的稳固、耐腐化使它成为蛋白测序理
想的用品,向来沿用到现在。
PVDF膜与硝酸纤维素膜相同,能够进
行各样染色和化学发
光检测,也有很广的合用范围。
这类PVDF膜,敏捷度、分辨率和蛋白亲和力在精美工艺下比惯例的膜都要高,特别适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用从前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子互换型转移膜:
硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用联合蛋白的,还有一类膜是依据离子互换的方式联合生物大分子的。
由DEAE(二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE
阴离子互换膜相同能够作为蛋白质印迹的固相支持物。
DEAE能够有效的联合阴离子基
团,包含那些高于其等电点的蛋白质。
在pH10以下,DEAE基团都能带电荷,在低离子
强度的转移液中联合蛋白分子。
其最适的pH环境为5-7。
DEAE膜能够用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。
这类0.45μm孔径的DEAE膜,除了能够做WesternBlotting外,还可以够用于核酸联合研究。
还有一种离子互换型膜是羧甲基(CM)修饰的纤维素膜,它能够联合蛋白和多肽分子,
以及其余的一些带正电荷的样品,最适联合pH范围在4-7。
联合的多肽分子能够从膜上洗脱下来,用于氨基酸系列剖析或微测序。
CM
5.Marker的有关疑问
MM.我用的是可视marker(BIO_RAD),但是电泳总跑不全8条带,请问什么原由?
如何改良?
胶用过8%,10%,12%,都是这样。
marker是新买的。
一般来说,是小分子量Marker跑走了,增添胶浓度或减少电泳时间试一试看。
自然梯度胶也是不错的选择。
NN.用的是RochemolecularBiochemicals企业的由100kd,75kd,45kd,30kd,20kd,
10kd构成的marker。
开始做WesternBlot时还可以够看到marker,自然也仅能看见此中最多三条带。
用80V进行SDS-PAGE电泳,用恒压10V45min转印的。
前几次做WesternBlot
时没有进行丽春红染色,但只管用了此方法也仅能看到marker有一条大概是30KD的条
带出现。
再就是把
70KD和130KD两个目的蛋白同时
在一块胶长进行剖析,用培育基样
品进行剖析,没实用间接法,而是直接用交融蛋白
C端的
V5表位的酶联抗体
(Anti-V5-HRP
)。
但就是出不来结果,
我很茫然。
感谢您过赐予指点!
1、“我用的是RochemolecularBiochemicals企业的由100kd,75kd,45kd,30kd,20kd,10kd构成的marker。
”有的时候,PrestainedMarker放久了成效就会变差,电泳是条带不清楚,扩散。
但是你的问题可能还有其余的方面的问题,可能是蛋白跟膜联合的不
密切。
转移是多加点甲醇。
2、“前几次做WesternBlot时没有进行丽春红染色,但只管用了此方法也仅能看到
marker有一条大概是30KD的条带出现。
”转移时半干法建议用恒流,你这样的也就
30kd-50kd的转移地比较好。
3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶长进行剖析,用培育基样品进行
剖析,没实用间接法,而是直接用交融蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)。
”
能否检测了表达量,二抗是不是好的,你做了阳性比较?
你要做这么大的蛋白最好转移
时间延伸到1.5hrs。
6.染色的选择
OO.WesternBlot哪一种染色好?
(1)阴离子染料是最常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5
μg,考马固然与氨基黑有相同的敏捷度,但脱色慢,背景高。
丽春红S和快绿在检测
后简单从蛋白质中除掉,以便进行随后的氨基酸剖析。
弊端是:
溶剂系统的甲醇会引
起硝化纤维素膜的皱缩或损坏。
不可以用语正电贺的膜。
敏捷度低。
(2)胶体金,敏捷度高,检测范围可到pg级,但染色比稳固。
(3)生物素化敏捷度位于1、2之间,可用于任何一种膜。
7.参照的疑问
PP.能否WesternBlot实验半定量必定要加ACTIN内参?
关于发布文章的实验最好加内参,实验谨慎。
QQ.用BANDSCAN剖析结果行吗?
剖析一般的结果没问题。
RR.核内抗原WesternBlot内参选择什么适合?
能够采纳组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳固的,有好多都能够当作内参,在网上查查就能够选出你要的内参。
SS.转膜时采纳电流能否比电压正确,能否依据0.8mA/cm2,一般1小时左右?
不是的,半干法介绍用恒流,一般依据目的蛋白的大小来确立电流和时间。
TT.做半定量人卵巢癌细胞系的WesternBlot,内参B-actin,GAPDH,那个好?
采纳beta-actin就能够。
8.缓冲液配方的常有问题
UU.转膜后的脱脂奶粉关闭时,所用的防沫剂
A是什么?
还有
Tris-HCl
是不是就是用
Tris
和盐酸配出来的呢?
转膜后的脱脂奶粉关闭液是
5%的
TBST脱脂奶粉。
-HCl
就是
盐用
HCl
调ph值,配置而成。
VV.准备做大鼠脑子的WesternBlot,蛋白质位于细胞核中,请问此蛋白质的提取液及
操作方法是?
每一步都一定要低温吗?
这类蛋白质是磷酸化的蛋白质,操作时如何防备去磷酸化的发生?
能够用提取总蛋白的buffer提核蛋白,能够加NaF防备去磷酸化。
WW.想问一下细胞裂解液选择蛋白酶克制剂时有什么原则吗?
受不受组织根源的影响?
胞膜和胞浆有差别吗?
一般来说提取时加入光谱的蛋白酶克制剂就能够了,操作时保持低温。
除非有文件特别指明用特别的方法,一般来说都没有差别。
XX.近来作了两次WesternBlot,不只没阳性结果,显色背景都没有,电泳和转膜都染
过,有条带。
底片和显色液及
DAB显色液均试过,没问题。
1、检测
GAD--分子量
67kd,
提取液有蔗糖,其余同三去污裂解液。
蔗糖不会有影响把?
样本
--20
度搁置一周内测。
2、一抗搁置2年,可能效价不高!
用的是1:
100。
假如是一抗的原由,不会背景都没有
把?
3、第一次有不平均背景,因为一抗留宿时密封袋不平均。
后两次无背景显色。
4、
关闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST,漂洗液用的是含1%BSA的TBST液,TWEEN-20为
0.1%,不会是关闭液的问题吧?
能够在下边几个问题上找找原由。
1.关闭液用5%Milk,漂洗液(washingbuffer
用TBST)2.看看一抗能否能work,降到1:
20。
3.看看二抗能否有问题。
YY.加甲醇的目的是什么?
加甲醇起着必定的固定作用,因为小分子蛋白质简单转出去.(特别是在硝酸纤维
素膜上,因为NC膜联合蛋白质的能力较弱)。
ZZZ.“转膜后的脱脂奶粉关闭液是5%的TBST脱脂奶粉”,此中TBST最后那个T是Tween
吗,浓度多大?
是Tween,配方以下
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