三代测序原理技术比较Word文档格式.docx
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aoio)
1x)im].
一1
ffflAft1
<
I9M6>
1:
测序技术的发展历程
生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的
研究有着十分重要的意义。
以上(图1)所描述
的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺
旋结构以来’整个测序技术的发展历程。
第一代DNA测序技术用的是1975年由桑
格(Sanger)和考尔森(Coulson)开创的链
终止法或者是1976-1977年由马克西姆
(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明的化学
法(链降解)•并在1977年f桑格测定了第一个基因组摩列f是噬菌体X174的f全长5375个碱基lo自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实蹉之中不断对其进行改进。
在2001年f完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础fSanger法核心原理是:
由于ddNTP的
2'
和3’都不含垠基f其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断
DNA合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:
ddATPfddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影后可以根
据电泳带的位置确定待测分子的DNA鹿列(图
2)。
这个网址为sanger测序法制作了一个小
短片,形象而生动。
值得注意的是,就在测溜技术起步发展的这
一时期中,除了Sanger法之外还出现了一些其
他的测序技术,如焦磷酸测序法.链接酶法等。
其中,焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2-4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测摩方法2f4f
但他们的共同核心手段都是利用了Sangerl中
的可中断DNA合成反应的dNTPo
Dr.FredSanger
FrederickSangerwasawardedthepftze血both1958and19^80.Hetsthefourthpersontnthev^orldtohavebeenawardedtwoNobelPrizesandtheonfypersontoreceivebothtnchemistry.
•dideaxy"
sequencingtechnique(Sangeret此1977)
DNA奴脫氣链终止法测序
图2:
Sanger法测摩原理
第二代测序技术
总的说来,第一代测摩技术的主要特点是测
序读长可达lOOObpr准确性高达99.999%f但其测序成本高,通量低等方面的缺点f严重影
响了其真正大规模的应用。
因而第一代测摩技术并不是最理想的测溜方法。
经过不断的技术开发和改进,以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa,Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
第二代测序技术大大降低了测疫成本的同时,还大幅提高了测摩速度f并且保持了高准确性,以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间,而使用二代测序技术则仅仅需要1周>
但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。
表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5f以下我将对这三种主要的第二代测溜技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。
FirstGeneration
Sequencing
SecondGeneration
Sequencing
图3.测摩成本的变化
i.
Illumine
Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说
是目前全球使用量最大的第二代测序机器,这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。
这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法,它的测序过程主要分为以下4步,如图4.
(1)DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小
片段,目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之夕卜注要是打断成200-500bp长的序列片段f并在这些小片段的两端添加上不同的接头,构建岀单链DNA文库。
(2)Flowcell
Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道,当文库建好后,这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。
每个Flowcell有8个channelf每个channel的表面都附有很多接头f这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对(这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因)f并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩増。
(3)桥式PCR扩增与变性
桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为
模板,进行桥形扩増,如图4・a所示。
经过不断的扩增和变性循环,最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束,每_个束都含有单个
DNA模板的很多分拷贝f进行这一过程的目的
在于实现将碱基的信号强度放大,以达到测序所需的信号要求。
(4)测摩
测摩方法采用边合成边测摩的方法。
向反应
体系中同时添加DNA聚合酶.接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP(如同Sanger
测序法)。
这些dNTP的3’-OH被化学方法
所保护,因而每次只能添加一个dNTP。
在
dNTP被添加到合成链上后f所有未使用的游
离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。
接着f再加入激发荧光所需的缓冲液,用激光激发荧光信号,并有光学设备完成荧光信号的记录,最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
这
样荧光信号记录完成后,再加入化学试剤淬灭荧光信号并去除dNTP3’-OH保护基团f以便
能进行下一轮的测序反应。
Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题,它的主要测序错误来源是碱基的替换,目前它的测序错误率在1%-1.5%之间f测摩周期以人类基因组
重测序为例,30x测序深度大约为1周。
Adapters
./Nudeotides
/;
Bridgeamplification
Addunlabelednudeotidesandenzymetoinitiatesohdphasebodgeamplification
Attached
PreparegenomicDNAsampleRandomlyfragmentgenomeDNAandligateadapterstobothendsofthefragments.
11
Laser
Firstchemistrycycle:
determinefirstbase
Toinitiatethefirstsequencingcycle,addallfourlabeledreversibletefminators,pnmers.andDNApolymeraseenzymetotheflowcell
Imageoffirstchemistrycycle
Afterlaserexcitation,capturetheimageofemittedfluorescencefromeachdusterontheflowtell.Recordtheidentityofthefirstbaseforeachcluster.
Beforeinitiatingthenextchemistrycycle
Theblocked3'
terminusandthefluorophorefromeachincorporatedbaseareremoved・
GCTGA...
Sequencereadovermultiplechemistrycycles
Repeatcyclesofsequencingtodeterminethesequenceofbasesinagivenfragmentasinglebaseatatime.
图4.Illumina测摩流程
Roche454
Roche454测序系统是第一个商业化运营二代测摩技术的平台。
它的主要测摩原理是(图5abc)2:
(1)DNA文库制备
454测摩系统的文件构建方式和Illumina
的不同,它是利用喷雾法将待测DNA打断成
300-800bp长的小片段f并在片段两端加上不
同的接头,或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩増f连接载体f构建单链DNA文库
5a)。
(2)EmulsionPCR(和夜PCRf其实
是一个注水到油的独特过程)
454当然DNA扩增过程也和illumina的
截然不同,它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上f并在其上面孵育.
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大
的独立反应空间以进行DNA扩增。
其关键技术是"
注水到油"
(水包油厂基本过程是在PCR反应前,将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面,水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。
这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。
理想状态下f每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。
这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头
互补的DNA摩列f因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。
同时孵育体系中含有PCR反应试剂,所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩増,并且扩増产物仍可以结合到磁珠上。
当反应完成后,可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。
进过扩増,每个小片段都将被扩増约100万倍,从而达到下一步测序所要求的DNA量。
(3)焦磷酸测序
测摩前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋
白处理带有DNA的磁珠f接着将磁珠放在一种
PTP平板上。
这种平板上特制有许多直径约为
44um的小孔f每个小孔仅能容纳一个磁珠,通
过这种方法来固定每个磁珠的位置f以便检测接下来的测唐反应过程。
测摩方法采用焦磷酸测摩法;
1务一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中,启动测序反应。
测序反应以磁珠上大量扩増出的单链DNA为模板f每次反应加入一种dNTP进行合
成反应。
如果dNTP能与待测疫列配对f则会
在合成后释放焦磷酸
基团。
释放的焦磷酸基团
会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成
ATP。
生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测陰
反应中的荧光素分子并发岀荧光,同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录f最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测瘵结果。
由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同f因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的溜列。
反应结束后,游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATPf从而导致荧光淬灭f以便使测序反应进入下一个循环。
由于454测瘵技术中,每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行,因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。
454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长,当前454技术的平均读长可达400bp,并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同,它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度,如当摩列中存在类似于PolyA的情况时,测序反应会一次加入多个T,而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得,这就有可能导致结果不准确。
也正是由于这一原因,454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。
a
DNAlibrarypreparation
4.5hours
•Genomefragmentedbynebulization
•Nocloning;
nocolonypicking
•sstDNAlibrarycreatedwithadaptors.
•A/Bfragmentsselectedusingavidin-biotinpurification
8hours
AnnealsstDNAtoanexcessofDNAcapturebeads
EmulsifybeadsandPCRreagentsinwater-in・oilmicroreactors
Clonalamplificationoccursinsidemicroreactors
BreakmicroreactorsandenrichforDNA-positivebeads
7.5hours
•Welldiameter:
averageof44pm•400,000readsobtainedinparallel•AsingleclonedamplifiedsstDNAbeadisdepositedperwell
AQualityfilteredbases
AmplifiedsstDNAlibrarybeads
图5.Roche454测摩流程
L
Solid技术
2.
Solid测摩技术是ABI公司于2007年开始
投入用于商业测序应用的仪器。
它基于连接酶
法『即利用DNA连接酶在连接过程之中测窝图
6)2,4。
它的原理是:
SOUDfMsubstrate
Pladapter
Templates(?
quencc丁
1・Primeandligate
Glassdlde
Dibaseprobes
TTTTTTTT^^lmnniU225,
一ynnnzzz5*
uimir^
I*nnnzzz5*
WTTTTTT^
rTAAftM^iS1
Cleavage&
lte
Template
2ndbase
ACGT
5.Repeatsteps1-4toextendsequence
Ugatloncycle1
7M.(n<
ydet)
Universalseqpnm皂r(n)
Badge
8rwJgepr«
fintk}*pr
Universalseqprime*(n-1)
I'
TTwmwmTmv
4Universalseqpnmer(n-3j
3"
rwwmiwmn
Umzersaaseqpnnner(n-2>
3’rmrmrmTrrm
«
UrwersalseqprimerCn-4)y■imimBiumi
•Indk/itcspositionso(inteirogotionLigAtioncycle■23456*■
Primerround1
Umv«
fsJseqpnemr(n)
Templatesequence
PIadapter
6・Primerreset
2・Image
F1t>
ore5.(en<
e
7.Repeatsteps1-5withnewprimer
1baseshift
4.Cleaveofffluor
3*
21卅2小心牡胡皿
■■■■■4T"
"
fi•w,f!
■■■
Primerround2z-I
UniverwIWQprimerCGAATAcc
pumojEETd
3・Capunextendedstrands
Phosphause
8.RepeatResetwith•n-2,n-3,n-4primers
Readposition
—III
IDDIII
图6-a.Solid测序技术
(1)DNA文库构建
片段打断并在片段两端加上测摩接头,连接
载体f构建单链DNA文库。
(2)EmulsionPCR
Solid的PCR过程也和454的方法类似f同样采用小水滴emulsionPCR,但这些微珠比起454系统来说则要小得多,只有lumo在扩増的同时对扩増产物的3'
端进行修饰,这是为下一步的测序过程作的准备。
3,修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。
在微珠上样的过程中,沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域(图6-a)oSolid系统最大的优点就是每张
玻片能容纳比454更高密度的微珠f在同一系
统中轻松实现更高的通量。
(3)连接酶测摩
这一步是Solid测摩的独特之处。
它并没有
采用以前测序时所常用的DNA聚合酶f而是采用了连接酶。
Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物f这里将其简单表示为:
3’
-XXnnnzzz-5r。
连接反应中f这些探针按照
碱基互补规则与单链DNA模板链配对。
探针
的5’末端分别标记了CY5.TexasRed.CY3.
6-FAM这4种颜色的荧光染料(图6-a)o这
个8碱基单链荧光探针中,第]和第2位碱基
(XX)上的碱基是确走的f并根据种类的不同
在6-8位(zzz)上加上了不同的荧光标记。
是Solid的独特测序法『两个碱基确定一个荧光
信号,相当于
次能决定两个碱基。
这种测摩方
法也称之为两碱基测序法。
当荧光探针能够与
DNA模板链配对而连接上时f就会发岀代表第1,2位碱基的荧光信号f图6-a和图6-b中的
比色版所表示的是第lf2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。
在记录下荧光信号后f通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割,这样就能移除荧光信号,以便进行下一个位置的测摩。
不过值得注意的是f通过这种测序方法f每次测序的位置都相差5位。
即第一次是第1.2位,第二次是第6、7位……在测到末尾后,要将新合成的链变性,洗脱。
接着用引物n-1进行第二轮测序。
引物nl与引物n的区别是f
二者在与接头配对的位置上相差一个碱基(图
6-a.8)o也即是f通过引物n-1在引物n的基
础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置f因而就能测定第Q1位和第5.6位……第二轮
测序完成,依此类推,直至第五轮测摩,最终可以完成所有位置的碱基测溜,并且每个位置的碱基均被检测了两次。
该技术的读长在2x
50bpf后续瘵列拼接同样比较复杂。
由于双次
检测f这一技术的原始测摩准确性高达
99.94%f而]5x覆盖率时的准确性更是达到了
99.999%f应该说是目前第二代测序技术中准
确性最高的了。
但在荧光解码阶段,鉴于其是
双碱基确定
个荧光信号f因而一旦发生错误就
容易产生连锁的解码错误。
bDatacollectionandimageanalysis
Collect
colorimage
IdentifyIdentify
beadcolorbeads
Glassslide
CollectIdentifyIdentify
colorimagebeadsbeadcolor
PrimerroundLligationcycle1
Ptitntrrouhd2.ligationcycle1
Primerround3,ligationcycle1
Primerround4,ligationcycle1
Colorspaceforthissequence
Possibledinucleotidesencodedby&
achcolor
Teniiplatesequence
ATACAAGA
CGCACCTCGCGTGGAGTATGTTCT
Doubleinterrogation
With2baseencodingeachbaseisdefinedtwice
Decoding
Colorspacesequence
TAACAA(G?
)
Basezero
GCCACC
CGGT(GG)
TT
Possibledinucleotides
AlGGGA
IYYYI
ATGGA
Decodedsequence
Basespacesequence
图6-b.Solid测摩技术
测摩技术在近两三年中又有新的里程碑。
以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测席技术,被称之为第三代测序技术。
与前两代相比,他们最大的特点就是单分子测序,测序过程无需进行PCR扩增。
其中PacBioSMRT技术其实也应用了边
合成边测序的思想5f并以SMRT芯片为测序
载体。
基本原理是:
DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基(即是dNTP),在碱基配
对阶段,不同碱基的加入会发岀不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
同时这个
DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长
主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。
PacBioSMRT技术的一个关
键是怎样将反应信号与周
光背景区别岀来。
他们利用的是ZMW(零模波
导孔)原理:
如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。
小孔直径有考究,如果直径大于微波
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- 三代测序 原理 技术 比较