药学本科分子生物学实验指导Word格式文档下载.docx
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4.冷冻离心机冷却到4℃(预冷半个小时)。
准备冰盒。
5.戴口罩,戴手套。
6.每个EP管中,加入100mg左右的组织,加入1mLTrizol试剂,
7.超声破碎仪破碎细胞
8.剧烈震荡30秒,室温静置10分钟。
9.加入200uL氯仿(三氯甲烷),剧烈震荡30秒,室温静置5分钟。
10.离心:
4℃,13,000rpm,10min。
11.取新EP管。
将上层水相(约600uL)加入新EP管,
12.再加入500uL异丙醇,室温静置10分钟。
13.离心:
14.去上清夜,加入20-30uLDEPC水,55℃10min,以完全溶解RNA。
15.-70度保存提取的总RNA。
八、注意事项
1.RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类,除了细胞内源RNA酶外,外界环境中均存在RNA酶,所以操作时应戴手套。
2.RNA提取用品准备:
1)普通的玻璃器皿:
180℃烘干8小时(玻璃),研钵,小勺,试剂瓶若干个。
2)一次性使用的塑料制品:
枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌,烘干。
3)用烘烤过的药勺称取试剂。
4)用DEPC水配制试剂:
0.1%DEPC水:
37℃至少处理12小时,高压灭菌15min。
实验结果:
成功从植物中分离得到总RNA
实验项目二:
总RNA的纯化和鉴定(必做)
通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法
1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。
2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA
1、学会纯化植物总RNA的方法
2、学会定量、定性检测RNA的方法
移液器及吸头,水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计
乙醇能够消除核酸的水化层,使带负电荷的磷酸基团暴露出来。
在阳离子的足量时,可以中和暴露的磷酸残基的电荷,使RNA沉淀。
反复利用乙醇沉淀RNA,可以起到纯化RNA的作用。
由于细胞中70-80%的RNA为rRNA,总RNA电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。
动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18SrRNA;
植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA,可见4条或更多rRNA;
细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb,分别相当于细菌23S和16SrRNA。
RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。
出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。
高质量的RNA样品,OD260/OD280值(10mMTris,pH7.5)在2.0左右。
OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。
同一个RNA样品,假定在10mMTris,pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:
终浓度(ng/μl)=OD260×
n(稀释倍数)×
40
(一)
总RNA的纯化
1.提取的总RNA,加入75%乙醇500uL洗涤。
2.离心:
4℃,7,500rpm,5min。
3.去上清液,加入无水乙醇500uL洗涤。
4离心:
5.去上清液,空气干燥5-10分钟。
(RNA不可以完全干燥,防止复溶的时候困难)
6.加入20-30uLDEPC水,55℃10min,以完全溶解RNA。
(二)总RNA质量的检测(完整性的检测)
1.称取琼脂糖0.25g,溶于盛有30ml的50×
TAE(电泳缓冲液)的锥形瓶中;
母液为50×
TAE:
242gTris碱+57.1ml冰醋酸+37.2gNa2EDTA·
2H2O配成1L于4℃储备),
2.将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟(以琼脂糖完全熔化为准);
加热时应盖上盖子,以减少水份蒸发。
3.在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上,用清洁的挡板封住电泳板的两端形成模具;
4.从微波炉中取出已经完全熔化的凝胶溶液,片刻冷却后,用吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的两边封住;
5.向锥形瓶中加入10mg/ml的溴化乙锭(EB)1µ
l(终浓度0.5µ
g/ml,EB插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间后,能形成一种在紫外光下发光的络合物,容易观察),轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液;
6.将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中(避免出现气泡);
倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。
如果出现明显的气泡,可用刀片赶走,然后插入合适的梳子形成加样孔。
梳齿的位置应在电泳板底面以上0.5~1.0mm,这样琼脂糖浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔;
7.让凝胶溶液在室温下完全凝结(需1h左右)后小心将梳齿拔起;
待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶。
8.将凝胶安放到电泳槽内,向电泳槽加入电泳缓冲液(1´
TAE),要求没过凝胶;
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
9.在干净的一次性手套上混合RNA样品和6´
上样缓冲液(5µ
l样品混合1µ
l6´
上样缓冲液);
10.用枪将样品混合液缓慢加入点样孔内;
每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
并加入4ul的DNAmarker,作为标记。
11.接好电极插头。
出孔电压为100v(约2min);
出孔以后电压用70v,电流在40mA以上;
电泳30分钟左右,当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳,关上电源。
注意DNA或RNA的泳动方向,防止反方向泳动而跳海。
12观察:
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察电泳胶板。
RNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。
紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
电泳可见明显两条带,RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,说明抽提的RNA质量高。
常用电泳缓冲液制备:
1×
40MmTris-乙酸1mMEDTA
TPE:
90mMTris-磷酸2mMEDTA
0.5×
TBE:
45MmTris-硼酸1mMEDTA
凝胶加样缓冲液:
0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF40%蔗糖或(15%聚蔗糖40030%甘油)
(三)RNA浓度与纯度的检查
1.取样本RNA1µ
l加99µ
lDEPC处理水(稀释100倍);
2.准备一管DEPC处理水以调零;
3.开仪器后部的开关;
4.按“RNA”键即为检测RNA;
5.取比色皿一个,用DEPC处理水洗一遍;
6.加DEPC处理水到比色皿后将比色皿放置在仪器指定位置,按“blank”键调零(放比色皿时注意光面和毛面;
手接触毛面,光线透过的应该是光面);
7.取出比色皿,吸干前液;
8.吸样品液到比色皿的凹槽内,将比色皿放置在仪器指定位置,按“sample”键后记录下仪器显示的样品浓度和A260/A280值(其比值可以判断核酸样品的浓度,对于DNA样品比值应在1.6-1.8之间,小于1.6有蛋白质的污染,大于1.8有RNA污染对于RNA比值应在2.0以上,如果小于2.0表示蛋白质或苯酚的污染。
)
9.实验结束后将比色皿洗干净备用。
10.以下公式进行RNA浓度的计算:
1.RNA纯化时动作轻柔,防止RNA分子断裂
2.防止RNA酶水解RNA
3.乙醇沉淀RNA时,不可完全干燥,否则不可以RNA难以复溶
4.由于细胞中70-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。
5.
不同组织或细胞中提取RNA预期得率
植物叶片
100-200μg/g叶片
动物组织
200-400μg/g肝脏组织
动植物培养细胞
5-10μg/106细胞
革兰氏阴性细菌
2-10μg/mlDH5α过夜菌
血液
3-5μg/ml人全血
实验结果:
并且紫外分光光度法测得的RNA的浓度和纯度复合实验预期,可以进行下一步的RT-PCR的实验。
实验项目三:
PCR基因扩增
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
PCR反应
正确操作PCR仪器,学会做一般PCR反应。
移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,DNA扩增仪,台式高速离心机,PCR仪
六、实验原理
提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增,获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。
(一)RNA反转录产生cDNA
(均使用25ul的反应体系,使用大鼠GAPDH(甘油醛-3-脱氢酶)做引物)
1.oligdT1ULRNA总量2ug(根据测的样品浓度)DEPCH2O(15-oligdT-RNA)轻弹几下后离心,总体积共15ul。
2.72℃变性10min,迅速置冰上。
(可以在PCR仪上设定相应的程序)
3.一次加入下列试剂:
混匀,短时离心。
25ul体系
50ul体系
5×
MMLVRTbuffer
5ul
10ul
dNTP(25mM/each)
Rnaseinhibition(40u/ml)
0.6ul
1.2ul
M-MLV-RT(逆转录酶)
1ul
2ul
说明:
RNA酶抑制剂和逆转录酶在加样前从-20℃冰箱取出.所用的PCR管和吸取RNA所用的枪头都是DEPC水处理的,余用消毒的就可!
4.42℃60min95℃3min4℃∞进行逆转录.(可以在PCR上设定相应的程序)
(二)PCR
1.备一套新PCR反应管,按顺序加入以下物质
50ul体系(ul)
25ul体系(ul)
无菌水
35.75
17.875
10×
TaqbufferwithMg2+
5
2.5
dNTP(25mM/EACH)
4
2
引物1
1
0.5
引物2
cDNA
3
1.5
Taq酶
0.25
说明:
Taq酶加样前取出.cDNA用后存于-70℃冰箱.
用TAE稀释引物.10倍稀释为储存液,再5倍稀释为工作液。
2.加完样后混匀,稍离心.再加入15ul/管矿物油(mineraloil),封闭,防止液体挥发。
3.regularPCR(约1.5h)
95℃2min。
94℃30s,62℃30s,72℃1min。
(共35个循环)
72℃15min,4℃∞。
1.该实验使用的样品为RNA,因此在反转录过程中,要特别注意防止RNA酶的污染。
2.取反转录酶等酶类时,要轻轻混匀,避免起气泡。
分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部,因其粘度高,所以要慢慢地分取。
3.为防止RNA分解,应避免多次冻融,应将RNA少量分装后保存于-70℃中。
九、实验结果
成功从细胞总RNA中利用RT-PCR技术,扩增出目的基因。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的方法。
正确操作使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的方法
移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,台式高速离心机,PCR仪,琼脂糖,TE、水平电泳仪、EB
完全变性的条件下,RNA的泳动率与分子量的对数呈线性关系。
使用一定分子量的Marker作为标记,就可以检测出样品RNA的碱基对数,从而判断检测样品中是否含有PCR扩增产物。
通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的比值,可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。
12.观察:
1.EB有剧毒,实验时要小心操作
2.凝胶制作尽量均匀
3.电泳时间不可以太短也不可太长,太短Marker条带不能分开,时间太长PCR,可能跑出凝胶。
4.注意DNA或RNA的泳动方向,防止反方向泳动而跳海。
九.实验结果
在紫外透射仪上,琼脂糖凝胶于DNAmarker相应分子量的位置,可见清晰的DNA条带。
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- 药学 本科 分子生物学 实验 指导