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某些质粒还能整合到染色体DNA上(携带染色体上的基因),因此质粒的转移同时又是基因的转移。
由于质粒分子小,便于分离和提取,经改造后可以成为克隆基因的载体。
应用质粒作为基因克隆的载体分子,最重要的前提是要获得大量纯化的质粒DNA分子。
基因克隆实验中常将经改造后的质粒作为运送基因的载体,质粒DNA提取效率及质对后续实验步骤(如酶切、连接、转化大肠杆菌与PCR扩增等)的成功与否有着直接的关系,因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒具有重要意义。
碱裂解法基本原理为:
溶液I使细胞悬浮,EDTA与Ca“、Mg“螯合,抑制DNase活性;
溶液Ⅱ裂解细菌、变性蛋白质和少量质粒;
溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA共沉淀,质粒DNA复性。
目前从细菌中提取质粒DNA多采用碱裂解法,该法操作简便,但若明确其中主要试剂的作用,所提取的质粒DNA的纯度及质量会更高。
第一部分文献综述
1.质粒的研究
1.1质粒的定义[1]
质粒(plasmid)是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质,为双股闭合环形的DNA,存在于细胞质中,质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状,如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。
质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性,与细菌的遗传变异有关。
图1:
大肠杆菌质粒DNA图2:
PBR322质粒
1.2质粒的特征
1.2.1自主复制性
质粒DNA含有自己复制起始位点(Origin,简称ori)以及控制复制频率的调控基因,有些质粒还携带特定的复制因子编码基因,形成一个独立的复制子结构(Replicon)。
因此,质粒DNA能够摆脱宿主染色体DNA复制调控系统的束缚而进行自主复制,并产生少则一个或几个,多则成百上千个拷贝数。
野生型质粒的自主复制既可通过反义RNA及相关蛋白因子(如Rop蛋白等)与复制引物的互补钝化作用作用进行负调控,同时也可通过rep基因编码产物与复制阻遏物的互相作用进行正调控,进而保证质粒在特定的宿主细胞中维持特定的拷贝数。
1.2.2可扩增性
在革兰氏阴性细菌中,质粒的复制一般有两种形式,即严紧型复制(Stringent)和松弛型复制(Relaxed)。
严紧型质粒(如Psc101和p15A等)的复制由宿主细胞内DNA聚合酶Ⅲ介导,并为质粒上编码的蛋白因子正调控,这些蛋白因子极不稳定,在宿主细菌的正常生长过程中,每个细胞通常只能复制少数几个质粒拷贝(1—5个);
而松弛型质粒(如Pmb1和ColE1等)的复制需要半衰期较长的DNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶以及其他辅助蛋白因子的参与,与宿主细胞内蛋白质合成减弱或完全中断时,治理复制仍能持续进行,因此这类质粒在每个宿主细胞中通常具有较高的拷贝数(30—50)。
作为一种极端的情况,当宿主细胞进入生长后期,加入氯霉素(最终浓度为10—170μg/ml)抑制蛋白质的生物合成,阻断宿主菌的大部分代谢途径,则松弛型质粒利用丰富的原料及能量大量复制,最终每个细胞可以积累上千个DNA分子,这种操作成为质粒的氯霉素扩增[2]。
1.2.3可转移性
在天然条件下,许多野生型质粒可以通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞,甚至另一种亲缘关系较近的宿主菌中,这一转移过程依赖于质粒上的mob基因产物与其他蛋白因子的相互作用。
1.2.4不相容性
具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内,这种现象称为质粒的不相容性。
对于单拷贝质粒来说,当两个不相容的质粒进入受体细胞后,由于含有相同或相似的复制子结构以及质粒拷贝控制机制,因此两者并不复制,待受体细胞分裂时,两者被同时的均分机制被同时的分配到两个子细胞中;
在多拷贝质粒的情况下,虽然两个相容性质粒可以进行复制,但由于两者复制的起始频率是随即的,因而在细胞分裂前夕,两种质粒的拷贝数并不均等。
又由于这些不相容性质粒在两个子细胞中的分配只能按照拷贝数均分,无法辨认质粒的性质,因此造成两个子细胞中含有拷贝数并不均等的两种质粒。
这样经过若干次细胞分裂后,必然导致两种质粒在细胞中的独占性。
具有不同复制子结构的相容性质粒,尽管他们由于复制机制不同而造成各自拷贝数有差异,但在细胞分裂时,两种质粒在两个子细胞中均可保持等同的拷贝数,因而他们可以稳定地存在于同一受体细胞中。
1.3质粒在基因工程中的应用及常见质粒
在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体,如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点,不会影响两个抗生素基因的表达。
但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点,就会使抗四环素基因失活。
这时,含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素,但对四环素敏感。
没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素,而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。
pSC101与pBR322相似,只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。
质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。
1.4内切酶
限制性内切核酸酶(也可称限制性内切酶)是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。
细菌细胞内同时存在一对酶,分别为限制性内切酶(限制作用)和DNA甲基化酶(修饰作用)。
它们对DNA底物有相同的识别顺序,但生物功能却相反。
由于细胞内存在DNA甲基化酶,它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化,就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏,而对感染的外来噬菌体DNA,因无甲基化而被切割破坏。
所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士,它与DNA甲基化酶一齐构成了保护自己、抵抗外源入侵的DNA的防御机制。
如果入侵的噬菌体DNA没有完全被限制性内切酶切割破坏,残留的噬菌体DNA在复制时,由于DNA甲基化酶的存在,同样地也在识别部位进行修饰——甲基化。
限制性内切酶对这种复制后的噬菌体DNA就奈何不得,以致大量繁殖起来,该受体细胞也因此遭到了灭顶之灾!
目前已发现的限制性内切酶有数百种。
EcoRⅠ和HindⅢ都属于Ⅱ型限制性内切酶,这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA的双链,形成一定长度和顺序的DNA片段。
EcoRⅠ和HindⅢ的别序列和切口是:
EcoRⅠ:
G↓AATTC;
HindⅢ:
A↓AGCTTG,A等核苷酸表示酶的识别序列,箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少个酶解片段,因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断酶切口的数目,从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
用已知分子量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的分子[3]。
1.5质粒DNA的提取研究
1.5.1质粒DNA的提取方法
由于质粒的上述性质,基因克隆实验中常将质粒作为运送基因的载体,因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒具有重要意义。
目前已有多种方法从细菌中提取质粒DNA,如碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法,此外还有有机溶剂法等。
这些方法各有利弊,如煮沸法的剧烈过程较易破坏质粒DNA的结构,且不适于未经氯霉素处理的培养物;
SDS裂解法较温和,但产率低,操作步骤繁琐;
最常用的是碱裂解法,该法操作简便,所提取的质粒DNA产量和纯度均较满意,可广泛用于转化细菌、细胞转染、酶切分析和DNA重组等实验[4]。
1.5.2碱裂解法
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;
蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用.
1.5.3煮沸法
煮沸法是根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成的。
在基因工程中,DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。
限制性内切酶能识别特定的DNA序列,在一定的条件下切断双链DNA。
限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度,DNA的纯度和甲基化程度等。
对DNA进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。
对于单酶切,应选用该酶的最适缓冲液;
对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。
DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质、酚、氯仿、SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。
1.5.4SDS裂解法
SDS裂解法是将细菌悬浮液于等渗的蔗糖溶液中,用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁,再用SDS裂解细菌,从而温和地释放质粒DNA到等渗溶液中,然后用酚-氯仿抽提。
1.6提取质粒DNA一般步骤
1.7影响质粒提取的因素
质粒提取的得率和质量与很多因素有关,如宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附柱的吸附量以及提取过中所加的化学试剂等。
1.7.1宿主菌种类
质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中,多数情况下我们是从大肠杆菌中提取质粒。
大肠杆菌的菌株不同会影响质粒提取的质量。
从宿主菌如DH5α和TOP10中可以得到高质量的质粒DNA。
HBl01和它的衍生菌株,如TG1和JM系列会在裂解时产生大量的糖类,如果没有完全去除,将抑制后续实验中的酶活性,影响质粒DNA提取的质量。
另外,有些菌株有非常高的内切酶活性,会降低DNA的得率。
因此推荐使用DH5α和TOP10来提取质粒DNA。
1.7.2培养时间
从固体培养基平板上挑取一个单菌落,接种到培养物中(含有相关抗生素的液体培养基中),振荡培养12-16小时。
不应超过16小时,因为这时细胞开始裂解,使得质粒的得率降低,也会导致质粒丢失或质粒变异质粒扩增。
氯霉素能抑制宿主细胞蛋白质和DNA的合成,但对松弛型质粒的复制没有影响。
因此,在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质粒的拷贝数。
由于氯霉素抑制了宿主细胞蛋白质和DNA的合成,从而抑制了染色体的复制,但质粒复制所用的酶半衰期较长,故质粒仍可继续复制,这样既可增加质粒产量,又可降低细胞的数量,使细菌裂解液的粘度降低而便于操作。
常用于扩增的氯霉素浓度为170ug/ml。
1.7.3抗生素
在菌株的各生长阶段都应加入抗生素筛选。
现在用的许多质粒都不含有在细胞分裂时确保平均分配的par位点,无质粒的子细胞在无抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。
1.7.4各种化学试剂
50mM葡萄糖:
葡萄糖加入后只是使悬浮后的菌体不会快速沉积到管子的底部。
因此溶液中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有影响,所以说葡萄糖是可缺的。
10mM的EDTA:
目的是与菌体细胞中二价金属离子螯合,从而抑制DNA酶的活性和微生物的生长。
因此只要是在较短的时间里完成质粒抽提,DNA就不会被迅速降解,不加EDTA,问题也不大,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA
NaOH:
裂解细菌。
因此NaOH要从浓溶液新鲜稀释制备,这样可以保证NaOH没有因为吸收空气中的二氧化碳而使碱性降低,保证其降解细菌的能力。
NaOH裂解细菌时要注意时间不能过长,操作必须柔和,因为强碱会导致基因组DNA片段的断裂,剧烈的机械振动也会使基因组DNA片段断裂。
大量基因组DNA片段混入会影响质粒DNA提取的纯度[6]。
醋酸:
中和NaOH,防止碱性条件质粒DNA的断裂
十二烷基硫酸钠(SDS):
通过钾离子置换SDS中的钠离子形成不溶性的十二烷基硫酸钾(PDS),而SDS又专性和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,因此钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大多数蛋白质沉淀,同时菌体的基因组DNA也一起被共沉淀
酚/氯仿/异戊醇、酒精:
沉淀蛋白质。
酚/氯仿/异戊醇选用25:
24:
1的比例是使蛋白质沉淀的最佳条件。
1.8质粒提取过程中的注意事项
(1).加入溶液2后不要剧烈振荡,只需轻轻颠倒几次离心管。
(2).加入溶液2后,复性时间不宜过长,一般是5分钟,否则会使染色体复性。
(3).在用苯酚、氯仿抽提时应用TE缓冲液将原溶液的体积扩大,一般是200~300微升,以减少DNA的损失。
(4),在加入酚氯仿的步骤中,最好用未高温灭菌的离心管,因为高温过程中可能使管口变形,使得振荡混匀过程中酚氯仿容易溢出。
(5),溶液II不可冷冻,现用现配.
(6),在加入等量的酚氯仿离心后,离心管内三层物质,从上至下依次为DNA上清液,蛋白质,酚氯仿7,50%的乙醇可溶解DNA,故应该极其注意70%的乙醇是否盖子完好,否则稀释的乙醇有可能将所获得DNA溶解掉.
第二部分实验设计
2.碱裂解法提取质粒DNA
2.1实验原理
碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。
2.2实验样本、器材与试剂
2.2.1实验菌种
本实验用的是大肠杆菌
2.2.2实验器材
低温高速离心机旋涡振荡器Eppendorf管微量移液器移液器头电泳仪与电泳槽紫外透射仪
2.2.3实验试剂[7]
①.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖
25mmol/LTris-HCl(pH=8.0)
10mmol/LEDTA(pH=8.0)
溶液Ⅰ可成批配制,每瓶约100ml,在6.895×
104Pa高压下蒸汽灭菌15min,贮存于4℃
②.溶液Ⅱ新鲜配制0.2mol/LNaOH1%SDS
③.溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
④.酚(Ph7.8~8.0)
⑤.氯仿
⑥.TE(Ph8.0)
10mmol/LTris(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH=8.0)
⑦.6×
DNA上样缓冲液0.25%溴酚蓝40%(W/V)蔗糖水溶液
⑧.0.8%琼脂糖
⑨.EB(溴乙锭)10mg/ml用时终浓度为0.5ug/ml
⑩.3mol/LNaAc无水乙醇
2.3实验步骤
2.3.1收集菌体
将扩增的菌体收集1.5mlEP.管中。
每次4℃,12000r/min离心5min.
2.3.2裂解菌体
⑴将菌体沉淀重悬于100
用冰预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡10min.
⑵加200
新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内溶物,不可强烈振荡,放置冰上5min左右。
⑶加150
用冰预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,将管倒置后吗、温和地振荡10s,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物分散均匀,置冰上5min。
⑷4℃、12000r/min离心5min,将上清液转移到另一离心管中,并定量上清夜的体积。
2.3.4提取质粒DNA
ⅰ加等体积酚:
氯仿(1:
1),于上清夜中,振荡混合,4℃、12000r/min,离心5min,将上清夜转移到另一离心管中,冰定量上清夜的体积。
ⅱ加2倍体积的无水乙醇和0.1体积的3mol/LNaAc,室温下沉淀质粒DNA,振荡混合,放置30min。
ⅲ4℃、12000r/min离心30min。
小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出,再将附于管壁的液滴除尽。
ⅳ用冰冷的1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次(每次用500
),不要搅起沉淀,弃上清、倒置于滤纸上,使沉淀干燥。
ⅴ保存质粒取适量TE缓冲液溶解质粒DNA,混匀后-20℃保存备用。
3.质粒DNA检测
3.1.质粒DNA的定量及杂质检测
各取样品10μL释稀200倍后,分别测定OD260和OD280值,若OD260/OD280>
2.0,表明DNA中含有RNA杂质。
若OD260/OD280<
1.6,表明样品中含有酚或蛋白质。
3.2质粒DNA单酶切后的电泳检测
分别取四种方法得到的质粒DNA1μL,进行酶切,反应体系为20μL,在0.5mlEppendorf管中依次加入ddH2O,10℃酶切反应缓冲液,BSA,1μg质粒DNA,限制性内切酶SmaⅠ0.5μL于37℃酶切2h,加适当loadingbuffer混匀上样,在0.8%琼脂糖凝胶上电泳,采用5V/cm的电压,电泳3h,EB染色,取出凝胶置紫外灯下检测,拍照。
3.3PCR扩增HIL-12特异片段
引物为一对能够扩增1613bp的hIL-12基因的特异性引物:
①上游引物5’-TCCCCCGGGCCACCATGGGTCACCAGCA–3’
②游引物5’-ACCGGAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAG–3’。
分别取4种方法提取的质粒DNA为模板进行PCR扩增反应,PCR反应体系为20mL混匀后在下列循环参数下进行扩增:
94℃5min{94℃1min,64℃1min,72℃2min}30cycles72℃6min。
取4μLPCR扩增产物和1μL溴酚兰上样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,电压4V/cm,电泳2h[7]。
4实验结果
4.1质粒DNA的定量及杂质检测
将上面用4种溶液提取的质粒DNA做吸光度比较,观察实验结果,分析哪种溶液更适合提取质粒DNA。
4.2质粒DNA经smaI单酶切后电泳检测[8]
采用四种不同的方法抽提质粒pBI121(其片段大小为1.5kb),分别用smaI37℃酶切2h,琼脂糖凝胶电泳,通过电泳图了解NaOH和SDS哪种更适合提取质粒DNA。
4.3PCR扩增hIL-12特异片段
四种方法提取的质粒DNA扩增Hil-12,其基因片段大小为1613kp。
进过凝胶电泳的图来比较4种方法那种提取的质粒DNA多,哪种没有提取出质粒DNA。
5.讨论
碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+和Mg2+螯和,抑制DNase的活性,溶液II裂解细菌,变性蛋白质和少量质粒,溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀,质粒DNA复性。
因此如果实验中缺少了溶液Ⅰ,用LB液体培养基代替之也可以,只要在短时间内完成质粒的提取即可。
裂解细菌主要是溶液II中的NaOH,而不是SDS,所以叫碱裂解法,若只用SDS也能抽提得到少量质粒,这是因为SDS也是碱性的,但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。
另外,NaOH若不是新配制的,可能会由于空气中的CO2与NaOH作用,减弱了其碱性。
这一步操作要注意两点:
一是,放置时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂。
二是,混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。
加入溶液Ⅲ后,会有大量的沉淀生成,这是由于要SDS与蛋白质结合后,SDS与醋酸钾生成了PDS,PDS的溶解度要比SDS低的多,从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了。
若用醋酸钠代替醋酸钾,所得到的沉淀就会大大减少[9]。
第3部分设计体会
本论文自始至终是在张俊杰老师的悉心指导和关怀下完成的,在论文选题、试验方案设计、实验操作指导和论文指导修改等方面,都倾注了张老师大量的心血。
张老师渊博的知识、求真务实的科研态度、一丝不苟的工作态度深深的影响了我,使我受益非浅。
在思维方式上,他教会了我从各个角度各个方面以科学的态度去思考问题,在面对困难时解决问题的方法和换位思想;
在实验操作,讲述了很多的操作思想,教了我不少实验操作,并经常和我讨论工厂生产和实验室的异同,使我在实验中少走了很多弯路,在动手能力方面有了很大程度的提高;
在生活上,张老师对我无微不至的关怀,使我倍感温暖。
我衷心感谢张老师对我的辛勤培养和关怀照顾。
同时,感谢生其他老师在实验及其他方面给予指导和支持。
整个实验的顺利完成,还离不开本实验室的其他同学在实验过程中给予我许多热情的帮助,给我不少启发。
在此一并表示衷心的感谢。
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