β胡萝卜素和番茄红素提取分离与测定Word文档格式.docx
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番茄红素的提取、测定及番茄产品的开发研究等。
1.2国内对番茄红素的研究现状
对番茄红素的研究在2000年以前鲜有报道,近三年骤然升温,出现了大量综述类文章,内容包括:
番茄红素的性质和提取方法;
番茄红素及其研究进展;
番茄红素的保健功能的研究现状;
番茄红素生理活性的研究进展;
番茄红素及其生产应用研究;
番茄红素的生产工艺研究进展;
番茄红素分离与分析的研究进展等。
2类胡萝卜素提取分离的国内外研究进展
β—胡萝卜素是类胡萝卜素之一,也是橘黄色脂溶性化合物,它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素。
自1831年Wachenroder从胡萝卜根中分离结出晶状碳水化合物类的色素并以“胡萝卜素”命名至今,已有不少国内外学者对类胡萝卜素进行了研究。
邓宇等对番茄中番茄红素的提取进行了初步研究,认为用氯仿作提取溶剂、当料液质量比为1∶5浸提时间为7h浸提温度为35℃时浸取效果最好。
适当增加浸提次数及搅拌速度有利于提高番茄红素的提取量。
吉宏武等人以活化的硅镁型吸附剂与赛力特硅藻土(1:
1)作填料以已烷-丙酮-甲醇不同组成与比例的流动相洗脱柱温20℃为条件采用混合溶剂提取和自动柱层析分离方法和正已烷-丙酮-乙醇-甲苯(10:
7:
6:
7)与40%甲醇氢氧化钾浸提皂化12h的制备方法制备了4种类胡萝卜素——β-胡萝卜素、叶黄质、堇黄质、新黄质。
类胡萝卜素在硅胶G薄层上分离时由于不同类胡萝卜素的末端基团的不同因此具有不同的色谱行为。
彭光华等人用薄层色普法对枸杞中的类胡萝卜素进行了分离获得了玉米黄素、β-隐黄素和β-胡萝卜素。
胡晓丹等人对金盏菊花类胡萝卜素的最佳提取工艺进行了研究,结果表明,用石油醚:
丙酮(1:
1、V/V)、料液比为1:
25(g/ml)、45℃提取1小时,反复4次,效果最佳。
从所报道的文献分析得出,类胡萝卜素的提取多采用有机溶剂法。
随着色谱法的发展,国外科技工作者开始采用HPLC技术来分析类胡萝卜素,但是对其定量测定未做深入研究,分离制备方面的报道也较少。
二.仪器和试剂
仪器三角瓶(50ml)、分液漏斗(150ml)、蒸馏瓶(50ml)、普通蒸馏装置(或减压蒸馏装置)、漏斗、色谱柱、硅胶薄层板、量筒、烧杯、层析缸。
试剂胡萝卜、丙酮、石油醚(bp30~60℃)、硅胶(层析用,200~300目)、无水硫酸钠、石油醚(bp60~90℃)、丙酮:
石油醚(1:
9)(V/V)。
三.实验方案
1、含类胡萝卜素石油醚溶液的制备
将新鲜胡萝卜洗净、擦干,切去尾部,切碎。
称取碎鲜胡萝卜【1】10g于小研钵中,研碎。
碎胡萝卜移至50mL三角烧瓶中,每次用丙酮10mL萃取2次,再用石油醚(bp30~60℃)萃取固体两次,每次10mL。
把石油醚溶液加到丙酮液中。
在分液漏斗中将混合液与50mL饱和氯化钠溶液【2】振荡,分去下层,用蒸馏水洗涤上层液两次,每次50mL,分去水,用无水硫酸钠干燥石油醚液(约1h),把混合液倒入50mL圆底烧瓶中,热水浴加热蒸馏,除去溶剂,得固体。
在制得的固体物加入3mL石油醚(bp60~90℃)拌硅胶1g,在通风橱内抽干,得黄色硅胶颗粒,待上柱。
2、装柱和分离
取20cm*1cm色谱柱一根,垂直装置,以50ml三角烧瓶作洗脱液的接受器。
用镊子取少许脱脂棉【3】放于干净的色谱柱底部,轻轻塞紧,再在脱脂绵上盖一层厚0.5cm的海石砂(或用一张比柱内径略小的滤纸代替),关闭活塞,向柱内倒入石油醚(bp60-90℃)至约为柱高的3/4处,打开活塞,控制流出速度为1滴/s。
通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入层析硅胶。
用洗耳球轻轻敲打柱身,使填装紧密。
当装填到3/4时,再在上面加一层0.5cm厚的海石砂,操作时一直保持上述流速,注意不能使液面低于砂子的上层。
当液面流至离海石砂面1cm时,立即从玻璃漏斗加入已制备好的含胡萝卜素的黄色硅胶,随后用0.5ml石油醚洗下管壁的硅胶,如此连续2—3次,直至洗净为止,然后在色谱柱上装上滴液漏斗,用石油醚(bp60-90℃)作洗脱剂进行洗脱,洗1滴/s。
当有一黄色的谱带分出,待黄色组分绝大部分洗出时,把洗脱剂换成1:
9丙酮一石油醚(bp60-90℃)混液作洗脱剂进行洗脱,控制流出速度如前(这混液洗脱剂有助于混合物中极性较大的组分移动),又可分出两个黄色组分。
在45—90min内,柱中物料将全部洗脱出来。
观察这些物料通过柱子的移动情况。
在三角烧瓶中收集3份洗出液。
用纸色谱、薄层色谱对各段洗出液进行色谱分析。
3.薄层色谱法
样品:
柱色谱法中洗脱出的份样品液
展开剂:
1:
9丙酮一石油醚溶液
薄层板的制备:
取3片载波体,洗净,晾干。
在50ml烧杯中放置3g硅胶G,逐渐加入0.5%cmC水溶液8ml,调成均匀的糊状,将此糊状物倾于上述洁净的载玻片圣桑,用手将带浆的载玻片在水平的桌面上做上下轻微的颤动,并不时转动方向,制成厚薄均匀,表面光洁的平整的薄层板,然后放在水平桌面上,在室温放置晾干后放入烘箱中,缓慢升温至110℃,恒温0.5h,取出,稍冷后置干燥器中备用。
点样:
取出上述制好的薄层板,分别在距一端点1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。
用毛细管吸取少量样品液,在一块板的起点线上点第一个色带的样品液,根据柱色谱分离的色带,依次点样,如果样点颜色较浅,可重复点样,重复点样前必须待前次样点挥干后进行。
样点直径不超过2mm。
展开:
待样点干燥后,小心地放入已加入展开剂的250ml广口瓶中进行展开。
在瓶的内壁贴一张高5cm,环绕周长4/5的滤纸,下面浸入展开剂中,以使容器内被展开剂蒸气饱和。
点样一端浸入展开剂0.5cm(样点不浸泡在展开剂中)。
盖好瓶塞,观察展开剂前沿上升离板的上端1cm处取出,尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号,晾干后,量出展开剂和样点移动的距离,计算Rf值。
四.归纳分析
本实验是从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素和番茄红素。
而提取的方法是色谱法。
因为色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一,具有极其广泛的用途。
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配)的不同,或其他亲和作用性能的差异,使混合物的溶液流经该物质,进行反复的吸附或分配等作用,从而将各组分开。
流动的混合物溶液称为流动相,固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。
根据组分在固定相中的作用原理不同,可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等;
根据操作条件的不同,又可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
1、柱色谱法
柱色谱(柱上层析)常用的有吸附柱色谱和分配柱色谱两类。
前者常用氧化铝、硅胶作固定相。
在分配柱色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。
吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大,经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。
当待分离混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。
当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集;
或者将柱吸干,挤出后按色带分割开,再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
对于柱上不显色的化合物分离时,可用紫外光照射后所呈现的荧光来检查,或在用溶剂洗脱是分别收集洗脱液,逐个加以鉴定。
2、薄层色谱法
薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术,也用于跟踪反应进程。
它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。
薄层色谱是在载玻片上才、均匀铺上一薄层吸附剂,制成薄板,用毛细管将样品点在起点处,把此薄层板置于盛有展开剂的展开槽内,浸入深度为0.5cm,待展开剂前沿利顶端约1cm附近时取出,干燥后喷以显色剂,或在紫外灯下显色,测定斑点位置,计算比移值(Rf)(方法同低色谱法)。
由于层析是在薄层上进行的,故称为薄层层析。
薄层色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两类。
一般能用硅胶或活性氧化铝薄层色谱分开的物质,也能用硅胶或氧化铝柱色谱分开,凡能用硅藻土和纤维素作支持剂的分配柱色谱能分开的物质;
也可分别用硅藻土和纤维素薄层色谱展开,因此,薄层色谱常用作柱色谱的先导。
同时也可以用吸收剂非极性大孔吸附树脂,具本实验的类胡萝卜素具有末端带环的长链结构,故平均孔径为290~300A的X-5大孔吸附树脂更利于他们的吸附和吸附过程中的传质。
3、类胡萝卜素的分离
β-胡萝卜素和番茄红素是不饱和碳氢化合物,难溶于甲醇、乙醇,可溶于乙醚、石油醚、正已烷、丙酮,易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有机溶剂。
根据上面的性质,β-胡萝卜素和番茄红素常用的提取方法有:
有机溶剂提取液法【4】,酶反应法,微波辅助提取法,超声波辅助提取法,超临界流体萃取法等【5】。
本实验采用有机溶剂提取法,故可利用石油醚、丙酮、无水甲醇、乙酸乙酯和无水乙醇【6】等弱极性溶剂作为提取剂将它们从植物材料中浸提出来。
然后,根据它们对吸附剂吸附能力的差异,用柱色谱进行分离,用薄层色谱检测分离效果。
本实验采用的是以丙酮有机溶剂萃取类胡萝卜素,以石油醚为洗脱剂,柱内填充为硅胶进行柱色谱分离,然后在以(1:
9)丙酮一石油醚溶液为展开剂进行薄层色谱检测分离效果。
β-胡萝卜素和番茄红素的提取主要是从植物中提取,随着人们对环保食品的逐渐认同,天然色素逐步取代合成色素已是大势所趋,所以化学合成法生产β一胡萝卜素和番茄红素远景并不光明;
直接粉碎法只是将植物果实等粉碎,作为着色粉直接添加于食品中,只能算是粗加工:
酶反应法是利用特定的酶反应得到水分散性色素,微生物发酵法利用霉菌发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素,但两者共同的缺点在于既没有特别有效的酶或霉菌,而影响因素多,操作步骤复杂,形不成大的规模;
超临界流体萃取是一种处于工业开发阶段的新型食品、化工分离过程,要求工艺条件高,投资大,由于尚处于工业开发阶段,作为实验室小试尚可,但若中试、放大进行工业大规模生产,条件尚不成熟;
萃取法作为色素提取的基本方法,操作简单,投资小。
因此,采用此法用于β-胡萝卜素和番茄红素的提取,符合我国国情,而且提取阶段的初级产品即可作为产品销售,如果能在初级产品方面做更深入的研究,不失为β-胡萝卜素和番茄红素提取开发的首选方法。
五、注意事项
1,本实验采取的工艺不同于其他工艺,体现在原料粉碎时加入了稳定剂(5ml氨水和35ml乙醇)来防止β-胡萝卜素被氧化,由此可提高提取率。
2、色谱柱填装紧密与否,对分离效果很有影响。
若柱中留有气泡或各部分松紧不匀(更不能有断层或暗沟)时,会影响渗滤速度和显色的均匀。
但如果填装时过分敲击,又会因太紧密而流速太慢。
3、加入砂子的目的是。
在加料是不致把吸附剂冲起,影响分离效果。
4、为了保持色谱柱的均一性,使整个吸附剂浸泡在溶液或溶液中是必要的。
否则当柱中溶液流干时。
柱身干裂,影响渗滤和显色的均一性。
5、若不用滴液漏斗,也可用每次倒入10ml洗脱剂的方法进行洗脱
6、载玻片上涂层要均匀,既不应有纹路、带团粒,也不应有能看到玻璃的薄涂料点。
7、点样用的毛细管必须专用,不得弄混。
8、点样时,使毛细管液面刚好接触到薄层(滤纸)既可,均匀点样过重而使薄层破坏。
六.参考文献
【1】苏永恒蒋惠然李发生.番茄红素测定方法的研究进展.中国卫生检验杂志200414(6)
【2】余孔捷杨方卢声.分光光度法测定红辣椒及其产品中苏丹红Ⅰ.中国卫生检验杂志200414(5)
【3】隋晓.辣椒红色素晶体制备技术的研究.精细化工,199916(4)
【4】内蒙古农业科技2002(4):
12~13《胡萝卜素萃取工艺研究》白英,母智森,张广信(内蒙古农业大学食品科学与工程系)
【5】河南科学《类胡萝卜素的提取及分离方法研究进展》姬小明,邵慧芳,刘金霞,赵铭钦(河南农业大学农学院)第26卷第11期2008年11月
【6】食品工业科技《银杏渣中类胡萝卜素的提取及柱层析研究》唐仕荣,宋慧,刘全德,潘志雨,张恩会(徐州工程学院食品工程学院与食品资源开发与利用重点建设实验室)
题型:
名称解释(6个,12分)
填空(25分)
简答(40分)
问答(23分)
蛋白质
1.蛋白质一级、二级、三级和四级结构及化学键。
2.蛋白质的含氮量大约为16%。
3.不同pH值下AA、Pr带什么电荷。
4.AA颜色反应。
5.蛋白质亲水胶体的稳定因素有哪些?
6.蛋白质沉淀方法。
7.蛋白质变性。
8.哪3种AA具有紫外吸收特性?
哪些AA是酸性?
哪些AA是碱性?
9.名词:
AA等电点、Pr等电点、肽键、肽键平面、超二级结构、结构域。
核酸
1.名词解释:
核酸变性、复性、增色效应、减色效应。
3.DNA双螺旋结构的要点是什么?
结构的稳定因素有哪些?
4.核酸的紫外吸收特性。
5.蛋白质合成有关的三种RNA及其功能。
6.解链温度及其影响因素。
7.核酸变性后的特征。
糖
1.葡萄糖在水溶液中的分子存在形式有哪几种?
2.醛糖有哪三种氧化方式?
3.成脎反应,生成葡萄糖脎的单糖有哪几种?
4.双糖、多糖的分子基本组成、还原性、及糖苷键的类型。
脂类与生物膜
1、生物膜的组成。
2、磷脂的组成。
3、膜蛋白的分类及特点。
5、流动镶嵌模型的要点。
酶
1.酶催化作用的特点。
2.酶可分为哪六大类?
3.全酶、辅酶、辅基
4.E的活性中心、E的必需基团
5.决定酶高效催化作用的机制。
6.酶促反应动力学(各因素如何影响酶促反应速度)。
7.别构效应、别构酶、同工酶
生物氧化
1.呼吸链、氧化磷酸化、底物水平磷酸化、电子传递链磷酸化、高能键、P/O比、能荷
2.生物氧化与非生物氧化的异同点是什么?
3.电子传递链的组分
4.电子传递链(呼吸链)抑制剂及抑制部位
5.生物氧化的两种方式及如何产生ATP?
6.化学渗透学说的基本观点。
7.生物体中NADH存在的两种穿梭机制。
糖代谢
1.糖酵解过程,能量计算、限速酶以及三步不可逆反应、生理意义。
2.TCA循环过程,能量计算以及限速酶、生理意义。
4.糖异生途径的调节酶。
5.血糖的来源和去路。
脂代谢
1.磷脂酶水解部位。
2.饱和脂肪酸(偶数碳原子)的氧化、特点、能量计算。
3.甘油的降解与转化。
4.酮体包括哪三种?
蛋白质代谢
1.氮平衡、正氮平衡、负氮平衡、一碳单位。
2.氨基酸的脱氨基作用有几种方式?
3.不同动物氨的排泄方式有何不同?
4.尿素循环小结。
5.氨基酸的一般代谢途径及代谢产物的去向。
核酸代谢
1.比较不同生物体分解嘌呤代谢的最终产物。
2.别嘌呤醇有何作用?
3.嘌呤环与嘧啶环上各原子来源。
4.什么是从头合成途径?
什么是补救合成途径?
各物质代谢间的相互关系
1.糖代谢和脂代谢之间如何联系?
DNA的生物合成
1.半保留复制、半不连续复制、冈崎片段、前导链、后随链、复制叉
2.DNA复制有何特点。
3.DNA复制过程中需要的酶及蛋白质。
4.DNA复制过程。
5.DNA逆转录酶作用。
RNA的生物合成
1.复制和转录的区别。
2.转录的特点。
3.大肠杆菌RNA聚合酶由哪5个亚基组成?
它们的作用各是什么?
(核心酶、全酶)
蛋白质的生物合成
1.翻译、密码子。
2.遗传密码的特点。
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- 胡萝卜素 番茄 提取 分离 测定