植物组织培养实验讲义Word下载.docx

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铁盐贮备液必须贮存于琥珀色玻璃瓶中。

在贮备椰子汁（液体胚乳）的时候，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于-20℃的低温冰箱内。

作为一项规则，在使用这些贮备液之前必须轻轻拨动瓶子，如果发现其中有沉淀悬浮物或微生物污染，必须立即将其淘汰。

在制备贮备液和培养基的时候，应当使用蒸馏水或无离子水，以及高纯度的化学试剂。

表1-1MS培养基的贮备液

成分

用量（mg/L）

备注

贮备液Ⅰ（大量元素母液）

20×

KNO3

38000

定容于1000mL蒸馏水中。

每升培养基取此液50mL。

NH4NO3

33000

MgSO4•7H2O

7400

KH2PO4

3400

CaCl2•2H2O

8800

贮备液Ⅱ（微量元素母液）

200×

MnSO4•4H2O

4460

每升培养基取此液5mL。

ZnSO4•7H2O

1720

CuSO4•5H2O

5

H3BO3

1240

Na2•MoO4•2H2O

50

KI

166

CoCl2•6H2O

贮备液Ⅲ（铁盐母液）

FeSO4•7H2O

5560

Na2•EDTA•2H2O

7460

贮备液Ⅳ（有机母液）

甘氨酸

400

盐酸硫胺素

100

盐酸比多醇

烟酸

肌醇

20000

三、实验用品

1．用具器材 

电子天平（感量0.001g）、粗天平（感量0.5g）、冰箱、烧杯（1000mL、400mL、100mL、50mL）、量筒（1000mL、100mL、50mL）、试剂瓶（1000mL、250mL、150mL）、药勺、玻璃棒、移液管（5mL、1mL）、pH试纸（5.4-7.4）、橡皮吸球、橡皮筋、吸水纸、磁力搅拌器、高压灭菌锅等。

2．药品试剂

蒸馏水、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、95%酒精、蔗糖、琼脂、、各种培养基母液、各种所需化学药品（分析纯）。

四、实验操作步骤

（一）母液的配制

母液配制方法以MS培养基为例。

1．无机大量元素母液的配制

按培养基配方的需要量，用天平称取，并分别用100mL蒸馏水溶解，如溶解速度慢，可稍加热。

在1000mL烧杯中，按表1-1顺序依次慢慢混合已溶化合物溶液并搅拌，以免产生沉淀，定容至1000mL，倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱待用。

2．无机微量元素母液配制

按培养基配方需要量，用电子天平称取，并分别用100mL蒸馏水溶解，在1000mL烧杯中将上述溶液依次混合，定容至1000mL，倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱待用。

3．铁盐母液配制

按培养基配方需要量，用电子天平称取，分别在50mL烧杯中溶解后，再在1000mL烧杯中混合，定容至1000mL，倒入棕色试剂瓶（因铁盐不稳定，易分解）中，贴上标签，置于冰箱中保存。

4．有机母液母液配制

按培养基配方需要量，用电子天平称取，分别用50mL烧杯20mL蒸馏水溶解，在1000mL烧杯中依次混合，把pH调到5.5，定容至1000mL，倒入试剂瓶中，贴上标签，置于冰箱冷藏备用。

5．激素母液配制

各类激素用量较小，为了方便和准确，也配制成母液。

母液浓度可依需要和习惯灵活确定。

但注意各激素均不能直接用蒸馏水溶解，而用各种不同溶剂先溶解后再用蒸馏水定容。

例如2.4-D母液配制：

称取40mg2.4-D,用少量95%酒精或1NNaoH溶解后，再用蒸馏水定容至200mL，此时，该激素母液浓度为1mg/5mL。

一般地，NAA、IAA、IBA等生长素是醇溶性的，均可用少量95%酒精先溶后再蒸馏水定容，而KT、6BA、ZT等细胞分裂素可先用少量1NHCl或1NNaOH溶解后再用蒸馏水定容。

冰箱保存。

上述各种母液冰箱保存均不宜时间过长，储藏中如发现母液中出现沉淀或霉团时，应弃之。

（二）培养基的配制

以MS1L培养基为例。

（1）称琼脂10g（琼脂浓度0.8-1﹪）溶于2/3或一半以上所需培养基体积即700mL左右的蒸馏水中，加热煮融。

另称取蔗糖30g（糖浓度3%），待琼脂完全煮融断电后趁热加入，并搅拌使之溶解。

（在配制液体培养基时则无须加热，因为蔗糖甚至在微温的水中也能溶解。

）

煮琼脂的同时，可用量筒或移液管依次量取各种母液混合于一烧杯中：

无机大量母液50mL，无机微量、有机物、铁盐母液各5mL，激素母液种类及取量依不同培养基配方临时确定，如果由于特殊原因有必要在高压灭菌之后再加入维生素和生长素，那么在调节了pH值之后，可使这些物质的溶液通过孔径为0.22～0.45μm的微孔滤器消毒。

（2）将上述液体混合，并用蒸馏水定容为1000mL。

用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH值至5.8，调时应不断用玻璃棒搅动，并用pH试纸测试。

（3）趁热将培养基分装于约30个三角瓶（50mL）中，每瓶约20mL，每个25×

150mm的试管约装培养基15mL。

分装时应避免把培养基倒在瓶口上，否则易引起杂菌污染。

如果在步骤

（1）～（3）期间培养基开始凝固，应将装培养基的三角瓶置水浴中加热，只有当培养基为均匀的液态时才能分装；

（4）用包在纱布中的棉塞（它能阻止微生物污染，但可使气体自由交换），或其他适宜的塞或盖封严瓶口，做好标记；

（5）把已装入了培养基的培养容器装在铁丝篮里，外面包上一层铝箔以防止棉塞在高压灭菌时吸湿，在120℃（l.06kg/cm2）下灭菌15min；

如果所用的是已经灭过菌的不耐高温的塑料培养容器，培养基可装在250或500mL的三角瓶中，以铝箔或牛皮纸封住瓶口，进行高压灭菌（有的实验室也使用1000mL三角瓶，只是大三角瓶在分装时不太方便）。

灭菌后使培养基冷却到大约60℃，然后在无菌条件下将其分装到容器中；

（6）使培养基在室温冷却，在培养室中放置一周。

当用试管制备琼脂固化培养基时，最好把培养基做成斜面，这只要在冷却期间将试管斜置即可。

斜面培养基可为组织的生长提供一个较大的表面积，同时，拍照长在斜面上的培养物也比较容易。

Street（1977）说过，“在实验中由培养基制备上的错误所造成的问题比由任何其他技术过失所造成的要多”。

为了尽量减少人为的误差，必须严格按上列各个步骤进行操作。

应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。

所有的装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记，这样即使经过高压灭菌和长期贮藏之后也不难识别它们。

五、思考题

1．分析配制培养基的各种母液的原理及其注意事项，并作说明。

实验二无菌操作及愈伤组织的诱导

1．了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求。

2．初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种操作技术。

3．了解外植体愈伤组织诱导过程。

（一）无菌操作

1．玻璃器皿及金属器械的消毒

（1）玻璃器皿（培养容器）：

常常与培养基一起灭菌，如若培养基已先灭菌，而只需单独进行容器灭菌时，通常有两种方法。

一种是干热灭菌法，即在鼓风干燥箱内，于160～180℃条件下连续处理3h，冷却备用。

一种是湿热灭菌法，即利用高压蒸汽灭菌锅来进行灭菌处理，用时烘干处理即可。

实验室中通常采用后一种方法。

（2）金属器械的消毒：

如实验中经常用到的镊子、解剖刀、解剖针等，一般是在95%的乙醇溶液中浸蘸一下，然后于酒精灯火焰上烧灼，冷却即可使用，但要记住每次操作前后都要进行同样的处理。

2．材料的灭菌

在接种前，必须使材料完全灭菌，这是取得植物组织培养成功的根本保证。

为保证这一点，则需做到以下两点：

（1）要选取植物组织内部无菌的材料

为什么这么说呢？

因为当植物体（即我们今天所要用到的外植体）有伤口或病虫时，在组织的内部就会有细菌、微生物等，因此要选取没有伤口、病虫的健壮的外植体。

另一方面，应该在晴天，最好是中午或下午时取材，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材，因为这时植物表面的微生物易于滋生且不易清除，而晴天时，植物呼吸作用旺盛，并且自身有消毒作用。

所以这时的材料内源细菌污染小一些。

（2）完全杀死材料表面带有的各种微生物

表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面的全部微生物，又要不伤害材料本身。

因此要根据不同材料选用适当的消毒剂，合适的浓度和处理时间，灵活运用。

（3）常用消毒剂的种类

①漂白粉：

常用的低毒有效消毒剂，使用的浓度一般为5～10%或其饱和溶液，取用上清液，处理材料10～30min，杀菌效果好，且不易伤害组织。

其主要成分是次氯酸钙，易吸潮而失效。

因此要密封保存，用时随配随用。

②乙醇：

70～75%的乙醇具有较强的浸透力和杀菌力，生长组织只需浸10～30s。

常用作表面灭菌的第一步，因不能彻底消毒，往往还需使用其他消毒剂。

③次氯酸钠：

也就是市售安替福民，通常配成2～10%。

一般组织浸泡10～30min，分解出的Cl2起杀菌作用，易清除，且对植物无害。

④氯化汞（升汞）：

一种重金属化合物，有剧毒。

0.1～0.2%的氯化汞是一种效果极好的杀菌剂，一般浸泡3～12min。

用氯化汞消毒的材料要用无菌水反复冲洗，洗净残留的汞，否则对培养物会产生毒害作用。

3．无菌操作

植物组织培养是一种灭菌技术，因此不仅要求整个操作过程、一切用具、材料、培养室、工作人员的衣物都要灭菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作规程，如稍有疏忽，则会前功尽弃。

（1）房间消毒：

一种是紫外线灭菌法，一种是熏蒸的方法消毒。

（2）实验人员遵守规则：

A．进入无菌操作室之前要用肥皂洗手，去掉指甲中的污物；

B．进入无菌操作室之前要穿经过消毒的工作服、帽子、口罩、鞋等；

C．操作前用70～75%的乙醇擦手、擦工作台面，而且要经常擦拭；

D．不准讲话，也不能对着超净工作台呼气；

E．培养基和用具，每次新的操作前都要在火焰上消毒；

F．必须在火焰旁边进行操作，瓶口打开前须在火焰上灼烧一下，接种完成后，盖瓶塞之前，瓶口及瓶塞均要在火焰上灼烧一下，然后立即盖好。

（二）愈伤组织诱导

已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞，这个过程称为脱分化（dedifferentiation）。

来自于植物各种器宫的外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，改变了它们原有的特性而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织。

一般情况下，植物各器官和组织均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。

植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。

生长素是用于诱导愈伤组织形成的生长物质，常用的种类有2,4-D、IAA和NAA，所需浓度在0.01～10mg/L范围内；

常用的细胞分裂素是激动素、玉米素和6-BA，使用的浓度范围在0.1～10mg/L。

对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。

来自于不同植物、同一植物的不同器官或组织，产生的愈伤组织在质地和物理性状方面是有差别的。

在一定条件下，离体的外植体可以形成愈伤组织（即一块未分化的组织），形成愈伤组织的过程也是细胞的脱分化过程。

已有的实验表明，所有的多细胞植物，包括双子叶植物和单子叶植物，都有诱发愈伤组织形成的潜在可能性。

一般认为诱发愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于培养的条件。

外植体上损伤的细胞能释放一种自溶产物，对诱导细胞的分裂起着重要的作用。

但在培养基中还必须加人一些生长调节物质，才能使已经分化后静止的细胞恢复分裂、脱分化和生产愈伤织。

但是在实践中，能否成功地诱导出愈伤组织还是研究者们面临的一个重要问题，有很多植物的愈伤组织的诱导还是不太成功。

对有关植物细胞的生理、生长等研究工作来说，不能成功地诱导出该植物的愈伤组织就意味着实验的完全失败，后续植物细胞生理或代谢等的相关研究就根本无法开展。

要使培养的细胞或组织最终发育成一个完整的植物体，一般要经过愈伤组织的细胞脱分化、人工诱导再分化两个不同的阶段，因此在这些实验中愈伤组织的诱导是否成功也是关键的基本因素。

总之，愈伤组织诱导条件的选择在植物细胞培养技术中占据着非常重要的地位。

影响愈伤组织诱导的因素包括以下几个方面：

目前一般认为能够影响愈伤组织诱导形成的主要因素：

（1）不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异；

（2）培养基种类对愈伤组织诱导的影响；

（3）外源激素对愈伤组织诱导的影响；

（4）培养条件对愈伤组织诱导的影响：

湿度条件、温度条件、光照条件。

以植物体中分离出来的器官组织为外植体，在人工培养基和激素诱导下，均可保证离体组织延续生长，产生愈伤组织。

从模式植物胡萝卜直根切下的外植体容易培养产生上述结果。

茎叶外植体也可诱导愈伤组织发生。

此外，选取种子胚直接诱导愈伤组织也容易成功。

利用比较简单材料掌握培养原理后，再进行困难的、有兴趣的实验会容易得多。

1．用具器材

超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、玻璃记号笔、脱脂棉、火柴、加盖小烧杯、废液杯、刀片

2．药品试剂

70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、已灭菌培养基及无菌水、无菌纸

3．实验材料

新鲜胡萝卜

1．接种前准备

（1）按本实验目的事先配好培养基

胡萝卜愈伤组织诱导培养基：

MS+1.5mg/L2.4-D+0.2mg/LKT0.2mg/L

（2）接种室准备 

打开超净工作台开关（接种前开机15～30min），台内用70%酒精棉球擦拭干净（或喷雾消毒），台面上放置以下用具：

酒精灯、70%酒精缸、酒精棉球瓶、加盖小烧杯、废液杯、枪式镊子、解剖刀、无菌水、无菌纸、培养基、新鲜材料

2．接种前准备

培养材料灭菌，是组培技术中的重要环节，一方面要考虑灭菌剂的杀伤效力，同时，也要考虑植物材料的受损情况。

所以灭菌时间长短很重要。

灭菌时，胡萝卜用刀片刮去皮切成小块放入小烧杯中，倒入升汞10min，其间稍加摇动以充分灭菌。

也可在此之前先用70%酒精浸30s或1min表面消毒后，再用升汞灭菌。

10min后，倒去升汞溶液，用无菌水反复冲洗材料3遍以上，将升汞溶液及废水倒入废液杯中。

3．接种

（1）接种前用肥皂洗手（穿工作服，戴口罩和工作帽），然后用70%酒精棉球擦 

手表面消毒。

（2）将超净工作台上三角瓶的封口橡皮筋打开，整齐排列在接种台左侧。

（3）点燃酒精灯，将所用镊子、刀在酒精缸内沾以95﹪酒精后，在酒精灯火焰上灼烧灭菌，灼烧灭菌后放在支架上以防再污染。

在整个接种过程中，应每隔一段时间便将刀、镊子沾酒精灼烧一下灭菌，冷却后再用。

（4）用镊子打开无菌纸包装，夹出几张无菌纸置于台中央。

（5）外植体处理：

用无菌镊子取出外植体，置于纸上吸水并进行切割。

胡萝卜块用解剖刀切成一系列1cm左右厚的薄片，每片切成通过形成层的5mm见方的小块，这样每块外植体都包含韧皮部、形成层和木质部三部分，其外植体大小及厚度尽量一致。

（也可用打孔器）

（6）在酒精灯上方，左手握住三角瓶，右手轻轻打开并拿掉包头纸，将纸盖外面朝上置于台面上。

右手用镊子将胡萝卜片平摆放于培养基表面，轻轻按住外植体使其接触培养基。

注意接种材料要摆放均匀且保持一定密度，完毕后将三角瓶瓶口在酒精灯火焰上灼烧一下，然后用瓶盖封口，扎好橡皮筋，并用玻璃记号笔在瓶下方注明材料代号、培养基代号、接种日期及姓名等。

（7）将培养基放入培养室指定培养架上培养。

注意在超净工作台上接种时，应尽量避免说笑，打喷嚏。

打开包头纸时，注意不要污染瓶口，并进行瓶口灭菌。

另外还应注意，手臂切勿从培养基、无菌材料、切割用的无菌纸、接种器械上方经过，以避免再度污染。

五、培养与观察

接种后一周内，如有污染情况即可观察到，真菌污染菌丝清晰可见，呈黑、白各色。

如细菌污染，为粉红、白色或黄色粘稠菌斑，发现污染应及时转移未污染材料或处理掉。

未污染培养2-4周后，可在外植体或其切口处观察到已长出的疏松呈颗粒状愈伤组织。

六、思考题

记录接种情况并统计愈伤组织出愈率及污染情况。

实验三愈伤组织继代培养和分化培养

1．了解愈伤组织离体条件下增殖过程及条件。

2．掌握植物材料继代的方法。

3．了解愈伤组织离体条件下形态发生、器官再生作用。

4．理解愈伤组织培养和分化两个重要培养阶段的内在联系和不同之处。

在初代培养的基础上所获得的愈伤组织，数量还不够，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。

继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。

旨在繁殖出相当数量的愈伤组织，这些愈伤组织可进一步分化成无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。

继代培养的后代是按几何级数增加的过程。

一般来说，从接种外植体到出现愈伤组织，需要经过2周时间。

2周之内就可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。

首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭，不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长得更快。

2周以后，由于培养基中的营养成分已接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。

进行继代培养所用的培养基，和培养愈伤组织所用的培养基相同。

在严格的无菌条件下（接种箱内）将愈伤组织连同原来的外植体，一起移到新的培养基上。

愈伤组织的继代培养，一代为20d。

如果延长培养时间，培养基中的营养物质会减少，外植体也会分泌一些有毒物质，造成自身中毒。

20d以后，可以根据愈伤组织的大小，决定是继续进行继代培养，还是进行试管苗培养。

如果愈伤组织长到直径为1～1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需要进行第二次继代培养。

在愈伤组织进行继代培养期间，可以将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光。

愈伤组织见光后，颜色可以转为绿色。

植物生长调节剂是诱导愈伤组织增殖的重要因素，对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形成。

由离体培养愈伤组织细胞再生成完整植株有两种不同方式：

一是通过茎芽分化，再诱导生根，形成小苗；

二是通过体细胞胚胎发生形成小苗。

前者是一种单极性结构，后者是一种双极性结构。

继代培养中扩繁的方法包括：

切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。

切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。

这种方法简便易行，能保持母种特性。

培养基常是MS基本培养基；

分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。

培养基常是分化培养基。

若芽丛的芽较小。

可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。

增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。

在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。

但在达到相当数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。

从某种意义上讲，增殖只是储备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。

当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种想象通常称为玻璃化。

它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。

玻璃化为试管苗的生理失调症。

因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。

在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。

当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。

在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。

呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。

这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：

a、增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；

b、减少培养基中含氮化合物的用量；

c、增加光照

d、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；

e、降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生；

f、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、脱脂棉、火柴、刀片

70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（以下培养基配方供参考）

愈伤组织继代培养基：

MS+1.5mg/L2.4-D+0.2mg/LKT

愈伤组织分化培养基：

（1）MS

（2）MS+0.5mg/L6-BA

诱导产生的愈伤组织

1．将胡萝卜根外植体产生的愈伤组织在无菌纸上切割成5×

5mm大小，转移