食品的微生物的检验考试复习Word文档格式.docx

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在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。

（2特点：

在环境中存在的数量多，易于检出；

检测手段与方法简单；

具有一定的代表性。

（3）检验目的：

以指示菌在检验样品中存在与否以及数量的多少为依据，根据检出的情况，判断样品被污染的程度，间接指示致病微生物有无存在的可能，以及对人群是否构成潜在的威胁，对照国家标准，对检品的食用的安全性作出评价。

（4）类型

评价被检样品一般卫生质量、污染程度以及安全性指标：

菌落总数、霉菌、酵母菌等；

特指粪便污染指标：

大肠菌群、肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等；

其他指示菌：

包括某些环境不能检出的菌类。

菌落总数：

指一定数量或面积的食品样品，经过处理，在一定条件下培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，所得1g或1mL或1cm2检样中所含细菌菌落数量即为菌落总数，常用CFU（菌落形成单位，clonyformingunit）表示。

大肠菌群：

指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。

这些细菌均来自人和温血动物的肠道。

3）微生态制剂检测阶段

以乳酸茵、双歧杆菌为主，以调节生态平衡为目的的各种微生态制剂，检验其菌株的特性和数量。

4）现代基因工程菌和尚未培养菌的检测阶段

5）快速检测阶段

化学比色分析法、酶联免疫法（ELISA）、免疫胶体金试纸检测法。

生物芯片、传感器、色谱质谱检测仪。

特点：

实验准备简化、试剂少；

样品前处理简单；

分析方法简单、准确、快速。

第2章食品微生物检验技术

第一节培养基

在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基。

1、培养基中的主要成分及其作用

（一）营养物质：

N源、C源、无机盐、生长因子、水。

1、常用的N源物质：

蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏

2、糖、醇类物质

单糖：

葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖　

双糖：

蔗糖、麦芽糖、乳糖

多糖：

淀粉、纤维素、菊糖

醇类：

甘露醇、卫茅醇、甘油

（二）水用蒸馏水，不能用自来水。

（三）凝固剂

琼脂、明胶、血清等。

要求：

清一色、杂质少。

（4）抑制剂

1、作用：

鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率。

2、种类：

盐类：

氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等。

染色剂类：

煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红。

胆盐类：

猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐。

抗菌素：

青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素。

（5）指示剂

用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。

2、常用的指示剂：

酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。

二、培养基的类型

由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。

我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。

（1）根据培养基的物理状态来区分

1、液体培养基：

主要用于增菌培养、鉴别性培养，大型生产、科研等。

2、固体培养基：

用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。

3、半固体培养基：

观察微生物的动力，菌种鉴定等。

4、脱水培养基：

含有除水分外的一切成分的商品培养基，使用时加水灭菌。

（二）根据培养基的用途来区分

1、增殖培养基：

在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。

2、选择培养基：

在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。

分离培养用的培养基

名称用途

SS琼脂培养基沙门氏菌和志贺氏菌属分离

HE琼脂培养基志贺氏菌分离鉴别

伊红美蓝琼脂培养基大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别

麦康凯琼脂培养基（MacC）肠道致病菌分离

甘露醇高盐琼脂培养基绿脓杆菌分离鉴别

XLD琼脂培养基志贺氏菌、沙门氏菌分离

中国蓝琼脂培养基肠道菌分离鉴别

碱性琼脂培养基霍乱弧菌分离

高盐蔡氏琼脂培养基真菌、酵母菌分离

3、鉴别培养基：

在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。

这样的培养基称之为鉴别培养基。

名称用途

蛋白胨水培养基靛基质和霍乱红试验

乳糖胆盐发酵培养基大肠杆菌发酵乳糖试验

0.5%乳糖发酵培养基肠道菌生化试验（复发酵）

半固体培养基动力试验和菌种保存

三糖铁琼脂培养基（TST）肠杆菌糖发酵及硫化氢反应

氰化钾基础培养基沙门氏菌分离

脱羧酶试验对照培养基细菌脱羧酶试验

三、培养基制备的基本方法和注意事项

1、培养基的制备记录

每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间，制备的日期和制备者等。

2、培养基成分的称取

培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。

可将配方置于旁侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。

完全称取完毕后，还应进行一次检查。

3、培养基各成份的混合和溶化

指示剂应在调节好pH值后再加入；

煮溶后要补加足水份；

不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。

4、培养基pH的初步调正

灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2；

pH调整后，还应将培养基煮沸。

5、培养基的过滤澄清

液体培养基可用滤纸过滤法。

琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。

6、培养基的分装

斜面：

1/５管半固体培养基：

1/3管高层斜面：

1/4～1/3管平板：

13~15mL

7、培养基的灭菌

（1）含糖类或明胶的培养基：

113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。

（2）无糖培养基：

121℃灭菌15~20分钟。

（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。

（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。

8、培养基的质量测试

（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等,均应挑出弃去。

并测定其最终pH。

（２）将全部培养基放入36±

1°

C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。

（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好,应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。

9、培养基的保存

（1）基础培养基不能超过两周。

（2）生化试验培养基不宜超过一周。

（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。

培养基配制——器材：

培养基、玻璃器皿、天平、药匙

培养基配制——仪器：

灭菌锅、无菌操作台

培养基配制——装水：

以量桶装取适量蒸馏水于玻璃容器中；

于玻璃容器上标示培养基名称。

培养基配制——称药：

放上秤药纸并归零；

以秤药匙舀出适当量培养基

培养基配制——溶解培养基：

倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上

注意事项——配药结束：

清理配药桌面与天平；

清洗称药匙，擦干放回；

药品放回药品柜

培养基配制——分装：

调整分注器刻度；

分装试管；

盖上试管盖

培养基配制——灭菌：

放入灭菌锅灭菌

注意事项：

拿灭菌后物品记得带耐热手套

培养基的配制–平板培养基：

灭过菌的固态培养基于无菌操作台內倒制平板培养基

第2节微生物检验的基本操作技术

一、无菌技术

（一）什么是无菌技术？

指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。

（二）无菌环境：

无菌室、无菌柜、超净工作台

1、无菌室

（1）无菌室的结构：

更衣间、缓冲间、操作间。

（2）无菌室的消毒和防污染：

每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）。

每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）。

每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次。

2、超净工作台

超净台的使用与保养:

（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;

（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;

（3）让超净台预工作10－15分钟;

（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。

（三）无菌器材

灭菌器材：

玻璃器皿、培养基、无菌衣等。

消毒器材：

无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。

（四）无菌操作

1、目的：

（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；

（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。

2、进入无菌室前的准备

（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；

（2）用紫外线灭菌处理30~60分钟；

（3）检查无菌器材是否完备；

（4）洗手消毒；

（5）手部消毒后，再穿戴无菌工作服。

3、检验操作过程的无菌操作要求

（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；

（2）使用玻璃器皿应轻取轻放；

（3）在火焰正上方操作；

（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；

（5）在接种培养物时，动作应轻、准；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

无菌操作——取菌技巧（从斜面取菌）

1.接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红，后端铁棒部分过火。

2.试管前端过火。

3.打开试管盖。

4.试管倾斜，放入接种环。

无菌操作——取菌技巧（从平板取菌）

1.自平板上取单一菌落（方法一：

盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入；

方法二：

平板反面拿起）。

无菌操作——取菌技巧（从液体内取菌）

1.调整移液枪刻度。

2.插上灭过菌的枪头（用力插紧）。

3.按钮压至第一段（不可压至最底）。

4.深入液面下2-4mm。

5.慢慢释放按钮，即可吸取液体。

无菌操作——接菌技巧

1.试管前端过火。

2.打开试管盖。

方法一：

以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌。

以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液。

方法三：

以移液枪吸取菌液，按钮压至最底排出菌液。

无菌操作——错误示范

试管直放，空气中菌体容易掉入。

操作时距离火源远。

移液枪倒放，菌液容易流入。

注意事项——生物性废弃物：

放在正确位置以便灭菌。

二、微生物的接种与分离技术

（一）接种：

将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

１、接种工具和方法

接种和分离工具：

接种针；

接种环；

接种钩；

玻璃涂棒；

接种圈；

接种锄；

小解剖刀

常用的接种方法有以下几种：

1）划线接种：

在固体培养基表面作来回直线的移动。

2）三点接种：

把少量微生物接种在平板表面上成等边三角形的三点，让他们各自独立形成菌落。

3）穿刺接种：

用接种针蘸取少量菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。

4）浇混接种：

将待接的微生物先放到培养皿中，然后倒入冷却好的培养基，迅速轻轻摇匀，待平板凝固后，置于适宜温度下培养。

5）涂布接种：

先倒好培养基，让其凝固后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面做左右涂布，让菌液均匀分布。

6）液体接种：

从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中。

7）注射接种：

用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内。

8）活体接种：

用于培养病毒或其它病原微生物，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。

所用的活体可以是整个动物；

也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；

也可以是发育的鸡胚。

（二）分离纯化

１、倾注平板法

首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50℃左右的营

养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒温箱中培养。

单一细胞经多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

2、涂布平板法

首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼

脂平板上，然后用无菌的玻璃涂棒把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便

可以得到单个菌落。

３、平板划线法

最简单的分离微生物的方法是平板划线法。

用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。

当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

三、微生物的培养方法

（一）根据培养时是否需要氧气分

好氧培养；

厌氧培养：

最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。

（二）根据培养基的物理状态分

固体培养；

液体培养

第三节微生物常规鉴定技术

一、形态结构

主要通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

二、培养特性：

1）细菌的培养特性：

固体培养基：

观察菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性。

液体培养基：

表面生长情况（是否有菌膜、菌环出现）、浑浊度如何、是否有沉淀出现等。

半固体培养基：

观察细菌是否有运动、扩散情况。

2）酵母菌的培养特性：

大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落与细菌很相似，只是比细菌菌落大且厚。

液体培养基也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。

3）霉菌培养特性：

霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在适宜条件的培养基里菌丝无限伸长，沿培养基表面蔓延。

霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同的颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面的颜色常常不同。

三、生理特性试验

1、适应环境特性试验：

各种微生物对生活的环境均有不同的适应性，对这些环境因素的适应性实验是微生物检验研究的基本内容，也常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区分的微生物。

（1）生长温度试验：

各种微生物进行正常的新陈代谢均要有一定的生长温度范围，如果环境温度超出这个范围，便会对微生物产生不利影响，引起微生物生长停滞甚至大量死亡。

试验方法：

将微生物分别接种于5、10、20、30、37、41、45、55℃培养箱中培养1-2d，观察不同温度下各个微生物的生长情况，确定生长温度范围和最适温度。

同时还要做一个空白试验，即准备一只未接种的培养基试管在37℃下同时培养，若空白试管未见异常，则试验结果有效。

（2）耐热试验：

测定生物在不同温度下的抵抗能力。

普通微生物的营养体在60-70℃可存活30min，在100℃时几分钟即可死亡，而细菌芽孢及真菌孢子等对热的抵抗力就很强。

将纯培养物各取0.1mL，接种于一系列肉汤培养基中，分别置于50、53、56、60、65、70、80、90℃等不同的高温水浴中，隔水加热10min或30min后立即浸入冷水中冷却，然后一起放入37℃培养箱中培养24h，取出后观察各管中微生物生长情况。

以判断致死最低温度和致死时间。

空白：

同生长温度试验。

（3）生长pH实验：

环境酸碱度对微生物生长发育有很大的影响，每一种微生物都有各自的生长pH范围，可划分为最高、最适、最低生长PH。

大多数细菌和放线菌的最适生长pH在7.2-7.6之间，真菌类则大约在3.0-6.5的范围内生长。

按照不同的实验菌种选择适宜的液体培养基，用酸或碱调整培养基的pH（5.4，5.6,5.8……10.0等），然后将菌种分别接种于上述培养基中于37℃培养1-2d，定时观察各个微生物的生长情况。

判断微生物的最高、最适、最低生长的pH范围。

（4）耐盐实验：

观察渗透压对微生物生长影响。

不同微生物对盐的浓度要求不同，过高的盐浓度所形成的高渗透压会对微生物造成不利影响。

将普通肉汤培养液调成不同浓度的盐溶液（0、1、2、4、6%....10%等）经过灭菌后分别接种待试菌种，然后在37℃培养，观察微生物生长情况。

判断菌生长的氯化钠浓度范围及最适宜盐浓度。

2、生化试验：

指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。

（一）生化试验的方法

1）在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的pH值变化。

2）在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。

3）根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。

4）根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。

（二）生化试验的注意事项

1）待检菌应是新鲜培养物。

培养18~24h。

2）待检菌应是纯种培养物。

3）遵守观察反应的时间。

观察结果的时间，多为24或48小时。

4）应做必要的对照试验。

5）提高阳性检出率，至少挑取2~3个待检的疑似菌落分别进行试验。

（三）生化试验的范围

从食品质检的角度，主要是试验各种糖类能否作为碳源和能源被利用，对于氮源主要检验其对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、铵盐及硝酸盐的利用能力。

（四）生化试验

1）糖醇类代谢试验

①糖酵解试验（糖醇类发酵试验）

原理：

不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。

用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。

置36±

1.0℃培养1~3天，每天观察结果。

检视培养基颜色有无变化，小倒管中有无气泡。

一般常用的指示剂为：

酚红、溴甲酚紫、溴百里酚蓝

（红变黄）（紫红变黄）（蓝变黄）。

结果观察和记录：

产酸不产气，阳性，以“+”表示

产酸产气，阳性，以“⊕”表示

不产酸不产气，阴性，以“-”表示

②葡萄糖氧化发酵（O/F）试验

细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。

氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；

发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；

不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。

根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。

取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4天，每天观察结果。

结果观察与记录：

封油管未封油管

发酵型产酸（黄色）产酸（黄色）

氧化型不产酸（蓝色）产酸（黄色）

产碱型不产酸（蓝色）不产酸（蓝色）

③乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）

某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。

试验方法——奥梅拉法：

将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±

1℃培养48h，每1mL培养液加奥梅拉O’Meara试剂（加有0.3%肌酸或肌酸酐的40%氢氧化钠水溶液）0.1mL，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定结果。

（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P+

（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P—

④甲基红试验（M.R试验）

细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红变红色，为甲基红试验阳性；

有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红呈桔黄色，为甲基红试验阴性。

挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±

1℃或30℃（以30℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。

（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+；

（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，

迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。

2）氮源代谢试验

①靛基质（吲哚）试验

某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。

吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。

将待检菌小量接种于培养基中，于36±

1℃培养24~48h时后，沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5mL覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。

呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+；

无红色者，为阴性反应，记—

②尿素酶试验

某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚酞指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。

以此鉴别细菌。

挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇匀，于36±

1℃培养10，60和120min，分别观察结果。

或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。

培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。

培养基变成粉红色，为阳性，记+；

培养基颜色不变，为阴性，记—

③氨基酸脱羧酶试验

某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、鸟氨酸产生脱羧作用,生成胺类物质和CO2。

胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性，如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。

取待检菌，分别接种于含有