细胞生物学实验讲义Word文件下载.docx
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损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。
六、注意节约实验材料、药品和水、电等。
七、保持实验室内清洁整齐。
实验结束后,各组必须认真清理各自的实验台面,将器材清洗后点清数目,然后摆放整齐。
班级值日生负责清扫室内卫生,关好水、电开关和门、窗等,经教师允许后方可离开实验室。
八、有不遵守上述要求者,任课老师将终止其实验,并取消其当堂实验成绩。
实验一细胞形态结构的观察及大小测定
一、实验目的:
1、观察几种细胞的形态结构及植物细胞的胞间连丝。
2、掌屋用测微尺测定细胞大小的原理和方法。
二、实验原理:
测微尺分物镜测微尺(简称物微尺或台微尺)和目镜测微尺(简称目微尺),两者配合使用,可以测量细胞大小。
目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片,圆片中央刻有一条直线,此线分为若干格。
物微尺为一载玻片中央封固的小尺,长1mm,被等分为100格,长为0.01mm(10μm)。
当测量细胞大小时,不能用物微尺直接测量细胞,而只能使用目微尺。
因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像,而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变,在测量时需要先用物微尺来标定,求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度,然后再用以测定细胞大小。
将物微尺放在显微镜的载物台上,小心转动目镜测微尺,移动物微尺使两尺平行,起点线重合,然后找出另一处两尺刻度重合处,记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数(格数),按下式计算,在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度:
物微尺格数
目微尺每格所代表的实际长度=×
10μm
目微尺格数
例如:
目微尺是100格,其对应的物微尺是80格,则目微尺每格所代表的实际长度为80/100×
10=8μm。
测量某一细胞时,如果目微尺测得其横径为5格,则此细胞横径为8×
5=40μm。
三、实验用品:
普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签、烧杯、吸管、0.9%生理盐水、0.1%亚甲基兰、蒸馏水、吸水纸。
四、实验材料:
口腔黏膜上皮细胞;
洋葱内表皮;
西红柿;
芹菜;
韭菜;
红辣椒。
五、方法步骤:
(一)、细胞形态结构的观察:
1、涂片法:
人口腔上皮细胞的观察:
1)、在洁净的载玻片中央,滴一滴生理盐水。
2)、用消毒牙签的一端,在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下。
3)、把牙签上附有碎屑的一端,放在载玻片上的生理盐水滴中涂匀。
4)、用镊子夹起洁净的盖玻片,将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴,然后,轻轻地盖在水滴上。
然后在盖片的一侧加一滴0.1%亚甲基兰染液,在盖片的另一侧用吸水纸吸取,染色后细胞核被染成深蓝色,细胞质浅蓝色。
5)、用显微镜观察细胞形状,细胞呈扁平鳞状。
2、西红柿果肉细胞涂片制作似人口腔上皮细胞,但将生理盐水换成蒸馏水,且不必染色就可直接观察。
细胞大小和形状如何?
3、撕片法:
撕一小片植物表皮(洋葱、芹菜和韭菜),放在盛有一小滴蒸馏水的载玻片上,用镊子展平,盖上盖玻片在显微镜下观察。
4、取红辣椒一片,用刀片刮去果肉,将表皮制成临时装片,用显微镜观察表皮细胞,能看见胞间连丝吗?
(二)、细胞大小的测定:
1、将目微尺放于目镜内。
2、将物微尺放在显微镜的载物台上。
3、小心转动目镜测微尺,移动物微尺使两尺平行,起点线重合,然后找出另一处两尺刻度重合处。
4、记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数(格数),按下式计算,在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度:
目微尺每格所代表的实际长度=物微尺格数/目微尺格数×
10μM
5、将制作的各种细胞临时装片置于载物台上,测定细胞的大小(包括长径和短径)。
六、注意事项:
1、制作临时装片时避免产生气泡。
2、用物微尺标定的目微尺每格长度的数值代表在某一放大系统下的情况,这一数值会随物镜的放大率而改变,因此,在什么放大倍数物镜下标定的目微尺只能在同一放大倍数的物镜下测定细胞的大小。
七、作业:
绘出你所观察到的人口腔上皮细胞、洋葱表皮细胞和芹菜和西红柿果肉细胞(或红辣椒、韭菜、韭菜表皮细胞)图,指出各部分的名称。
实验二动物细胞的显微结构
1、判断和识别光镜下四种不同组织动物细胞的形态结构及大小。
2、掌握动物细胞与植物细胞的区别。
二、实验材料:
1、人血涂片观察。
2、疏松结缔组织永久制片观察。
3、骨骼肌细胞纵横切永久制片观察。
4、心脏切片观察。
5、平滑肌纵横切永久制片观察。
6、脊髓前角运动神经元观察。
三、作业:
1、绘制人血涂片中各种血细胞图(×
40光镜下),指出各细胞的的名称。
2、绘制脊髓前角运动神经元细胞图(×
40光镜下),指出各部分的名称。
实验三DNA的细胞化学反应——Feulgen反应
1、了解Feulgen反应的基本原理。
2、熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。
Feulgen反应是1924年由Feulgen和Rossenbeck开创的。
这一反应的原理是:
DNA经酸(1mol/LHCL)水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。
所以,凡有DNA的部位,会呈现紫红色阳性反应,可以作为定性研究DNA的一种简便方法。
紫红色的产生,是由于反应产物的分子内含有醌基,醌基是一个发色团,所以具有颜色。
对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理,抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应,从而证明了Feulgen反应的专一性。
(一)药品:
1、Carnoy固定液:
3份95%酒精加入1份冰醋酸,混合即可。
2、1mol/LHCL:
准确量取82.5ml浓盐酸(比重1.18)加蒸馏水到1000ml即可(应将盐酸缓缓加入水中)。
3、Schiff试剂:
称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中,5分钟后断电使其冷却至55~50℃,过滤到一个棕色的试剂瓶中,加入1mol/L
HCl
20ml,继续冷却至25℃,加入1g偏亚硫酸氢钠,摇动瓶子使其溶解。
密闭瓶口,置黑暗低温处或冰箱内(4℃左右),18~24小时后检查,试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用,这就是Schiff试剂溶液。
如有不同程度的红色未褪,可加入1g活性炭,强烈震荡一分钟,仍在低温下静置过夜,然后用滤纸过滤后使用。
密封瓶口,包以黑纸,在5℃以下冰箱内可以保存半年。
4、亚硫酸水溶液(漂白液):
在200ml蒸馏水中,加入10ml
1N
和10ml
10%偏亚硫酸氢钠水溶液(或1.0g固体)。
此液在临用前配制。
否则会因SO2的的逸出而失效。
5、5%三氯乙酸。
6、0.5%固绿酒精溶液(95%的酒精溶解)。
7、45%醋酸。
(二)用具:
显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、剪刀、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、镜头纸、青霉素小瓶、吸管、烧杯、量筒。
Carnoy液固定的大蒜根尖。
1、材料准备:
取大蒜若干头,剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。
待根尖长1cm时,剪下根尖固定在Carnoy固定液内24小时以上备用,固定时以冰箱中进行为宜。
2、水解:
实验时,从冰箱取出预先准备好的大蒜根尖,分装到若干个青霉素瓶中,用自来水洗3次,蒸馏水水洗3次,换1mol/L
HCl洗一次,倾去,换入预热60℃的1mol/LHCl
3ml,放入恒温水浴锅中在60±
0.5℃下水解8-15分钟(视材料而定,水解时间可以从8分钟延长至30分钟)。
然后吸去热1mol/LHCl,换入冷1mol/LHCl洗1次,再用蒸馏水将根尖洗3次。
水解是本实验成败的关键之一。
重要的是温度,应保持在60±
0.5℃之间。
如果温度过高或时间过长,造成水解过度,醣与醛基之间的键被破坏,醛基流失到水解液中;
反之,不能出现潜在的醛基,都不能呈现颜色反应。
3、染色:
吸净水分,加入Schiff试剂避光染色40min~60min,用漂洗液漂洗2~3次,每次5min,然后经自来水流水冲洗,再用蒸馏水洗2次后准备压片。
4、压片法:
取一根尖置于载玻片上,用刀片切下生长区部位(染成紫红色),加一滴0.1%亮绿水溶液对染一分钟,吸去亮绿液,加一滴清水或45%醋酸水溶液,加盖玻片,用拇指轻压使细胞分散均匀,镜检。
5、对照组预先用5%三氯醋酸(90℃)处理15min,然后再依次进行实验步骤
(二)、(三)、(四)。
1、Feulgen反应的染色深浅与材料、水解时的温度和时间都有关系。
水解时间的长短要根据固定液和材料来进行选择,时间太短则游离的醛基量少而染色不深,时间太长会因醛基进一步变成其它物质,染色也不深。
水解时的温度要严格控制。
2、未经水解的对照切片在schiff试剂中最多不要超过1h(40分钟即可),时间过长,试剂本身的酸性也会使DNA水解,从而出现假的正反应。
3、Schiff试剂的作用:
Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素,就是schiff试剂的质量。
有一大类试剂均称为碱性品红,它们实际上是由几种产品分别组成的。
因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。
此外,Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
4、漂白液的重要性:
漂洗时,所用的亚硫酸水,最好在每次实验前临时配制,以便保持较浓的SO2。
5、操作过程中,用镊子镊取根尖的生长区部位,切勿夹取根冠部位。
1、简述Feulgen反应的染色原理。
2、绘图表示Feulgen反应的染色结果,并验交Feulgen反应的压片1张。
实验四细胞有丝分裂各期观察
1、掌握细胞分裂各期的主要特点。
2、掌握动物细胞和植物细胞在细胞分裂过程中的区别。
有丝分裂,又称为间接分裂,由W.Fleming(1882)年首次发现于动物及E.Strasburger(1880)年发现于植物。
特点是有纺锤体染色体出现,染色体被平均分配到子细胞,这种分裂方式普遍见于高等动植物(动物和低等植物)。
细胞有丝分裂过程可分为细胞核分裂和细胞质分裂,细胞核分裂可分为:
前期,中期,后期,和末期.不同时期的染色体的形态和行为是各不相同的。
前期:
染色质丝高度螺旋化成染色体,纺锤体出现,细胞核分解,核仁消失。
中期:
染色体排列在细胞中心赤道板位置,其着丝点与纺锤丝相接。
后期:
染色体分裂成染色单体,每一条向不同方向的细胞两极移动。
末期:
染色体到达两极后解螺旋形成染色质丝,纺锤体消失,核膜、核仁重建。
在细胞核分裂进入后期以后,细胞质开始分裂,从而将一个细胞分裂成两个子细胞。
三、实验材料:
1、自制大蒜根尖压片3-4片。
2、洋葱根尖纵切永久制片。
3、马蛔虫卵切片永久制片。
马蛔虫受精卵细胞中只有2-6条染色体,而大蒜和洋葱体细胞的染色体为16条,因为它们都具有染色体数目少的特点,所以便于观察和分析。
四、有丝分裂各期观察:
1、自制大蒜根尖压片的观察
首先在低倍镜下,区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞,然后,在高倍镜下,观察细胞核的形态,注意在你的片子上,是否有有丝分裂细胞,如有,你能找到细胞分裂期的几个阶段,其特征如何?
植物细胞分裂的几个时期。
细胞周期分为间期及分裂期,按照有无核膜,核仁、染色体,以及染色体形态与分布位置的变化,细胞有丝分裂又分为前期、中期、后期和末期四个阶段。
现将各期特点简述如下,
(1)前期:
此期的染色质螺旋盘绕成一定数目的细而长的染色丝,此即染色体。
染色体先是分散于核液中,以后,逐渐向核膜移动,在此时,核仁逐渐消失,核膜溶解。
(2)中期:
染色体进一步盘绕,变短变粗,在细胞的中央(即赤道板)规则地排列成行,仔细观察,可看到染色体两侧的纺锤丝。
(3)后期:
姊妹染色体分别向细胞两极移动,染色体达到两极时染色体紧缩成团,染色体的轮廓逐渐变得不清楚,细胞质中间部位(细胞的赤道板)形成细胞板。
(4)末期:
盘绕变粗的染色体又伸展开,此时,核仁、核膜又重新出现。
此外,间期细胞的细胞核有下述特点:
核膜清楚,核内结构均匀,除异染色质外,可见1-2个着色较深的核仁。
而在进入细胞分裂期的细胞核,一般均大于间期细胞核。
2、洋葱根尖纵切永久制片观察(同大蒜根尖)
将洋葱根尖切片标本先在低倍镜下观察,寻找生长区,这部分的细胞分裂旺盛,大多处于分裂状态,细胞形状呈方形。
换高倍镜仔细观察不同分裂时期的细胞形态特征.与动物细胞有丝分裂特征比较,找出植物细胞有丝分裂的特点和两者的区别。
3、动物细胞有丝分裂的观察——马蛔虫子宫切片(马蛔虫受精卵切片永久制片观察)
取马蛔虫的子宫切片标本,先在低倍镜下观察,可见马蛔虫子宫腔内有许多椭圆形的受精卵细胞,它们均处在不同的细胞时相。
每个卵细胞都包在卵壳之中,卵壳与卵细胞之间的腔,叫卵壳腔。
细胞膜的外面或卵壳的内面可见有极体附着。
寻找和观察处于分裂间期和有丝分裂不同时期的细胞形态变化,并转换高倍镜仔细观察。
间期(Interphase)
细胞质内有两个近圆形的细胞核,一为雌原核,另一为雄原核。
两个原核形态相似不易分辨,核内染色质分布比较均匀,核膜、核仁清楚,细胞核附近可见中心粒存在。
图马蛔虫受精卵的有丝分裂
分裂期(Mitosis)
前期(Prophase)雌、雄原核相互趋近,染色质逐渐浓缩变粗、核仁消失,最后核膜破裂、染色体相互混合,两个中心粒分别向细胞两极移动,纺锤体开始形成。
中期(Metaphase)染色体聚集排列在细胞的中央形成赤道板,由于细胞切面不同,此期有侧面观和极面观的两种不同现象,侧面观染色体排列在细胞中央,两极各有一个中心体,中心体之间的纺锤丝与染色体着丝点相连;
极面观由于染色体平排于赤道面上,2-6条染色体清晰可数,此时的染色体已纵裂为二,但尚未分离。
后期(Anaphase)纺锤丝变短,纵裂后的染色体被分离为两组,分别移向细胞两极,细胞膜开始凹陷。
末期(Telophase)移向两极的染色体恢复染色质状态,核膜、核仁重新出现,最后细胞膜横缢,两个子细胞形成。
五、注意事项:
马蛔虫是真核生物中染色体数目最少的物种,二倍体马蛔虫的染色体数目为2条或4条,三倍体为6条。
在观察切片时要注意所观察卵的染色体数目的不同。
注意:
1)马蛔虫受精卵是动物细胞,在细胞分裂过程中与植物细胞有所不同。
首先最明显的不同就是,植物细胞的赤道板在后期可形成细胞板,而动物细胞却不能。
2)细胞的整体分裂形式也不太一样,植物细胞是细胞板的缢裂,动物细胞是细胞膜中部向内凹陷缢裂成两个子细胞。
3)再有,高等植物细胞内没有中心体。
马蛔虫的细胞内有中心体,在有丝分裂过程中,中心体会进行复制,然后发出星射线牵引染色体等等。
六、作业:
1、说明动植物细胞有丝分裂的区别。
2、绘制马蛔虫受精卵或大蒜根尖细胞、洋葱根尖细胞有丝分裂的各期细胞图像,并注明结构名称?
实验五细胞凝集反应
1、观察血细胞的凝集现象。
2、掌握凝集素促使细胞凝集的原理。
细胞质膜是由蛋白质不同程度镶嵌在脂双层中所形成的动态流动结构,蛋白质和脂类分子又与寡糖链结合为糖蛋白和糖脂分子,糖蛋白和糖脂分子伸至细胞表面的分枝状寡糖链在质膜表面形成细胞外被(又称为糖萼)。
许多研究结果表明:
细胞间的分子识别、细胞的生长和分化、免疫反应和肿瘤发生等均与细胞外被(分枝状寡糖链)有关。
凝集素(1ectin)是一类含糖的(少数凝集素例外)并能与糖进行专一性结合的蛋白质,它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。
凝集素促使细胞凝集主要是由于它能与细胞外被的糖分子相连接、在细胞间形成“桥”的结果,加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应。
1、器材
显微镜、托盘天平、载玻片若干、5mL注射器、滴管2支、离心管2支。
2、试剂
①PBS缓冲液:
称取NaCl7.2g、Na2HP041.48g、KH2P040.43g、加蒸馏水,定容至l000mL中,调pH值到7.2。
②1%肝素溶液:
称取肝素钠0.1g,定容至l0mL生理盐水中即可。
3、实验材料
①土豆块茎。
②2%红细胞悬液
以无菌方法抽取兔子耳缘静脉血液(5mL注射器用1%肝素溶液浸润)1mL,用生理盐水洗5次,每次3000r/min,离心5min,最后按沉淀压积的红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞悬液。
四、实验方法:
称取土豆去皮块茎2g,切成小块
↓
加10mLPBS缓冲液,浸泡2h(浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素)
载玻片上滴一滴土豆凝集素
再滴一滴2%红细胞液
↓充分混匀
静置20min
低倍显微镜下观察血球凝集现象
以PBS液加2%血细胞悬液作为对照实验,低倍显微镜下观察。
五、作业:
1、绘制简图,表示血细胞的凝集过程。
2、图示血细胞凝集的原理。
实验六细胞膜的渗透性
1、了解溶血现象及其发生机制。
2、了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜,可选择性控制物质进出细胞。
各种物质出入细胞的方式是不同的,水是生物界最普遍的溶剂,水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散,这种现象就是渗透。
渗透作用是细胞膜的主要功能之一。
将红细胞放在低渗盐溶液中,水分子大量渗到细胞内,可使细胞胀破,血红蛋白释放到介质中,由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液,这种现象称为溶血。
将红细胞放在某些等渗盐溶液中,由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同,有的溶质可进入,有的溶质不能进入,进入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压,使水进入红细胞,引起溶血。
由于溶质透入速度不同,溶血时间也不同,因此,发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。
本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料,将其放入不同的介质溶液中,观察红细胞的变化。
1、器材:
50ml烧杯、10ml移液管、滴管、试管12支、试管架。
2、试剂:
0.017mol/L氯化钠、0.032mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化钠、0.32mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸钠、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸钠、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮、0.9%生理盐水。
兔血。
1、50%兔红细胞悬液的制备。
制备流程如下:
以无菌方法抽取兔子耳缘静脉血液(1mL兔血加0.9%生理盐水9mL)
混匀,离心(3000rpm)5min
弃上清取沉淀
加0.9%生理盐水,
离心(3000rpm)5min,重复3次
弃上清取沉淀,用生理盐水稀释,制成50%兔红细胞悬液备用
2、溶血现象的观察:
取试管2支,分别加入0.017mol/L氯化钠和0.032mol/L葡萄糖低渗溶液3ml,再加入2滴制备好的50%兔红细胞悬液,注意观察溶液颜色的变化,由不透明的红色悬液变成透明的血红蛋白溶液(红细胞发生破裂,造成100%红细胞溶血,使光线比较容易透过溶液)。
3、红细胞的渗透性:
(1)取试管一支,加入0·
17mol/L氯化钠溶液3ml,再加入2滴制备好的50%兔红细胞悬液,轻轻摇动,混匀后静置于温室中,观察试管中发生溶血的时间及其变化。
注意是否有颜色变化?
是否有溶血现象?
为什么?
(2)分别在下列几种等渗溶液中进行实验,步骤同
(1)。
0.32mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.17mol/L硝酸钠、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸钠、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮。
1、离心机使用时,要将配平后的离心管对称放置在离心机内,禁止未配平就放入离心机和非对称放置离心管。
2、试管中有红细胞和测试溶液时,不应强力摇晃,以免造成人为的红细胞破裂。
3、目测法判断标准:
快速溶血:
+++;
慢速溶血:
++或+;
不溶血:
-。
记录观察到的现象,并对实验结果进行分析和比较。
编号
溶液种类
是否溶血
溶血所
需时间
结果分析
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
实验七小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察
1、通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。
2、掌握小白鼠腹腔注射给药和颈椎脱臼处死方法。
巨噬细胞起源于骨髓,经血液进入组织中而成,分布于全身各处。
当机体受到某些损伤因素时(如微生物或其它病原体或异物侵入),能招引巨噬细胞,同时巨噬细胞有趋化性,主动向病原体或异物游走,在接触到病原体或异物时,细胞膜凹陷伸出伪足包围异物,并发生胞吞作用形成吞噬泡,继而巨噬细胞质中的溶酶体与吞噬泡融合,消化分解异物。
含台盼蓝的淀粉肉汤,可使腹腔中有较多的巨噬细胞,以供观察吞噬活动。
1、仪器设备:
显微镜、注射器、注射针头、吸管、试管架、剪刀、解剖刀、解剖镊、载玻片、盖玻片、记号笔。
①0.85%
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- 细胞生物学 实验 讲义