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(一)经典柯赫法则
著名的柯赫法则(Koch’spostulates)是确定某种细菌是否具有致病性的主要依据,其要点是,第一,特殊的病原菌应在同一疾病中查见,在健康者不存在;
第二,此病原菌能被分离培养而得到纯种;
第三,此纯培养物接种易感动物,能导致同样病症;
第四,自实验感染的动物体内能重新获得该病原菌的纯培养。
柯赫法则随在确定一种新的病原体时非常重要,但其有一定的局限性,某些情况并不符合该法则。
如健康带菌或隐性感染,有些病原菌迄今仍无法在体外人工培养,有的则没有可用的易感动物。
另外,该法则只强调了病原微生物一方面,忽略了它与宿主的相互作用,是不足之处。
(二)基因水平的柯赫法则
随着分子生物学的发展,“基因水平的柯赫法则”(Koch’spostulatesforgenes)应运而生。
其要点是:
第一,应在致病菌株中检出某些毒力或其产物,而无毒力菌株中则无;
第二,如有毒力菌株的某个基因被损坏,则菌株的毒力应减弱或消除。
或者将此基因克隆到无毒菌株内,后者成为有毒力菌株;
第三,将细菌接种动物时,这个基因应在感染的过程中表达;
第四,在接种动物检测到这个基因产物的抗体,或产生免疫保护。
该法则也适用于细菌以外的微生物,如病毒。
二、细菌毒力的测定
在疫苗研制、血清效价测定、药物筛选等工作中,都必须知道细菌的毒力。
细菌毒力的表示方法很多,最具实用的是半数致死量和半数感染量。
(一)半数致死量(medianlethaldose,LD50)
是指能使接种的实验动物在感染后一定时限内死亡一半所需的微生物量或毒素量。
测定LD50应选取品种、年龄、体重乃至性别等各方面都相同的易感动物,分成若干组,每组数量相同,以递减剂量的微生物或毒素分别接种各组动物,在一定时限内观察记录结果,最后以生物统计学方法计算出LD50。
由于半数致死量采用了生物统计学方法对数据进行处理,因而避免了动物个体差异造成的误差。
(二)半数感染量(medianinfectiousdose,ID50)
是指感染实验动物、鸡胚或细胞后在一定时限内使一半感染发病所需的微生物量。
因某些病原微生物只能感染实验动物、鸡胚或细胞,但不引致死亡,只能用ID50来表示其毒力。
测定的方法与测定LD50类似,只不过在统计结果时以感染者代替死亡者。
第二节细菌的毒力因子及分泌系统
构成细菌毒力的物质称为毒力因子(virulentfactor),主要有侵袭力和毒素,此外有些毒力因子尚不明确。
近年来的研究发现,细菌的许多重要毒力因子的分泌与细菌的分泌系统有关。
一、侵袭力(invasiveness)
病原菌在机体内定殖,突破机体的防御屏障,内化、繁殖和扩散的能力称为侵袭力。
(一)定殖(colonization)
细菌感染的第一步就是在体内定殖(或称定居),实现定殖的前提是细菌要粘附在宿主消化道、呼吸道、生殖道、尿道及眼结膜等处,以免被肠蠕动、粘液分泌、呼吸道纤毛运动等作用所清除。
凡具有粘附作用的细菌结构成份统称为粘附素(adhesin),通常是细菌表面的一些大分子结构成份,主要是革兰氏阴性菌的菌毛,其次是非菌毛粘附素,如某些外膜蛋白(OMP)以及革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(LTA)等。
细胞或组织表面与粘附素相互作用的成份称为受体(receptor),多为细胞表面糖蛋白,其中的糖残基往往是粘附素直接结合部位,如大肠杆菌1型菌毛结合D甘露糖、霍乱弧菌的4型菌毛结合岩藻糖及甘露糖、大肠杆菌的F5(K99)菌毛结合唾液酸和半乳糖。
部分粘附素受体为蛋白质,最有代表性的是细胞外基质(extracellularmatrix,ECM),ECM的成员有1型及4型胶原蛋白(collagen)、层粘连蛋白(laminin)、纤粘蛋白(fibronectin)等,如金黄色葡萄球菌的粘附素胶胡原合蛋白受体为胶原蛋白。
(二)干扰或逃避宿主的防御机制
病原菌粘附于细胞或组织表面后,必须克服机体局部的防御机制,特别是要干扰或逃避局部的吞噬作用及分泌抗体介导的免疫作用,才能建立感染。
1.抗吞噬作用:
包括以下几个方面。
第一,不与吞噬细胞接触,可通过胞外酶(如链球菌溶血素等)破坏细胞骨架以抑制吞噬细胞的作用。
第二,抑制吞噬细胞的摄取,如多糖荚膜、链球菌的M蛋白和菌毛。
第三,在吞噬细胞内生存,如沙门氏菌的某些成份可抑制溶酶体与吞噬小体的融合;
再如李氏杆菌被吞噬后,很快从吞噬小体中逸出,直接进入细胞质。
而金黄色葡萄球菌则产生大量的过氧化氢酶,能中和吞噬细胞中的氧自由基。
第四,杀死或损伤吞噬细胞,细菌通过分泌外毒素或蛋白酶来破坏吞噬细胞的细胞膜,或诱导细胞凋亡,或直接杀死吞噬细胞。
2.抗体液免疫机制:
细菌逃避体液免疫主要通过:
第一,抗原伪装或抗原变异,前者主要是在细菌表面结合机体组织成份,如金黄色葡萄球菌通过细胞结合性凝固酶结合血纤维蛋白,或通过SPA结合免疫球蛋白。
第二,分泌蛋白酶降解免疫球蛋白,嗜血杆菌等可分泌IgA蛋白酶,破坏粘膜表面的IgA。
第三,通过LPS、OMP、荚膜及S层等的作用,逃避补体,抑制抗体产生。
3.内化作用(internalization):
指某些细菌粘附于细胞表面之后,能进入吞噬细胞或非吞噬细胞内部的过程(图5-1)。
细菌一旦丧失进入细胞的能力,毒力则显著下降。
内化作用对细菌的意义在于,细菌通过这种移位作用进入深层组织,或进入血循环,细菌借以从感染的原发病灶扩散至全身或较远的靶器官。
宿主细胞为进入其内的细菌提供了一个增殖的小环境和庇护所,使细菌逃避宿主免疫机制的杀灭。
4.在体内增殖:
细菌在宿主体内增殖是感染的核心问题,增殖速度对致病性极其重要,如果增殖较快,细菌在感染之初就能克服机体防御机制,易在体内生存。
反之,若增殖较慢,则易被机体清除。
铁是许多细菌生长所必需,然而宿主体内无游离铁存在,细菌通过获铁系统为细菌生长提供所需的铁,获铁系统包括生产和利用载铁体或直接利用宿主的含铁化合物,如血红转铁蛋白、乳铁蛋白等。
赤藓醇(erythritol)能刺激布氏杆菌在体内的生长。
雄性及妊娠母畜生殖系统中有赤藓醇存在,因此布氏杆菌可在其中大量增殖,其感染局限于生殖系统。
5.在体内扩散:
细菌分泌的蛋白酶称为胞外蛋白酶(extracellularproteinase),它们具有多种致病作用,例如激活外毒素、灭活血清中的补体等,有的蛋白酶本身就是外毒素。
此外,最主要的作用是作用于组织基质或细胞膜,造成它们的损伤,增加其通透,有利于细菌在体内的扩散性。
此类常见的有1.透明质酸酶(hyaluronidase),旧称扩散因子(spreadingfactor),分解结缔组织的透明质酸。
2.胶原酶(collagenase),主要分解ECM中的胶原蛋白。
3.神经氨酸酶(neuraminidase),主要分解肠粘膜上皮细胞的细胞间质。
4.磷脂酶(phospholipase)(α毒素),可水解细胞膜的磷脂。
5.卵磷脂酶(lecithinase),分解细胞膜的卵磷脂。
6.激酶(kinase),能将血纤维蛋白溶酶原激活为血纤维蛋白溶酶,以分解血纤维蛋白,防止形成血凝块。
7.凝固酶(coagulase),细菌在体内的扩散也可通过内化作用完成。
特别是细胞结合性凝固酶,可为细菌提供抗原伪装外,使之不被吞噬或机体免疫机制所识别。
二、毒素(toxin)
细菌毒素按其来源、性质和作用等的不同,可分为外毒素和内毒素两大类。
在大多数情况下,外毒素一般简称毒素。
(一)外毒素(exotoxin)
是某些病原菌在生长繁殖过程中所产生的对宿主细胞有毒性的可溶性蛋白质。
大多数外毒素在菌体内合成后必须分泌于胞外,故名“外毒素”。
但也有少数外毒素存在于菌体细胞的周质间隙,只有当菌体细胞裂解后才释放至胞外。
1.特性:
外毒素通常具有菌种特异性;
外毒素的毒性作用极强;
外毒素的毒性具有高度的特异性;
外毒素具有良好的免疫原性;
多数外毒素不耐热;
外毒素都是蛋白质,具有酶的催化作用。
不同细菌产生种特异性的外毒素,如破伤风梭菌产生破伤风毒素、炭疽杆菌产生炭疽毒素、霍乱弧菌产生霍乱毒素等。
1mg纯化的肉毒毒素能杀死2000万只小鼠。
破伤风毒素对小鼠的致死剂量,是马钱子碱的106倍。
不同细菌产生的外毒素,对机体的组织器官有一定的选择作用,引起特征性的病症。
如破伤风毒素作用于脊髓前角运动神经细胞,引起肌肉的强直性痉挛;
肉毒毒素作用于眼神经和咽神经,引起眼肌和咽肌麻痹(图5-2);
但霍乱弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、气单胞菌等许多细菌均可产生作用类似的肠毒素。
外毒素可刺激机体产生特异性的抗体,而使机体具有免疫保护作用。
这种抗体称为抗毒素(antitoxin),可用于紧急治疗和预防。
外毒素在0.4%甲醛溶液作用下,经过一段时间使其毒性丧失,但仍保留原有抗原性,称之为类毒素(toxoid)。
类毒素仍可刺激机体产生抗毒素,可作为疫苗进行免疫接种。
多数外毒素一般在60℃~80℃经10min~80min即可失去毒性,但也有少数例外,如葡萄球菌肠毒素及大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)能耐100℃30min。
外毒素易被热、酸及蛋白水解素酶灭活,许多外毒具有酶的催化作用,有很高的生物学活性和特异性。
2.组成:
大多数外毒素由A、B两种亚单位组成,有多种合成和排列形式(图5-3)。
A亚单位为毒素的活性中心,称活性亚单位,决定毒素的毒性效应。
B亚单位称结合单位,能使毒素分子特异性地结合在宿主易感组织的细胞膜受体上,并协助A亚单位穿过细胞膜。
A、B亚单位单独均无毒性,A亚单位必须在B亚单位的协助下,结合至受体释放到细胞内,才能发挥毒性作用,因此毒素结构的完整性是其致病的必备条件。
B亚单位可单独与细胞膜受体结合,并阻断完整毒素的结合,B亚单位可刺激机体产生相应的抗体,从而阻断完整毒素结合细胞,可作为良好的亚单位疫苗。
3.分类:
外毒素的分类目前尚未统一,比较简明的是根据其性质分三类,A-B型毒素、攻膜毒素以及超抗原毒素。
(1)A-B型毒素(A-Btype)具有典型的A-B两个亚单位,多数外毒素均属此类。
例如霍乱毒素、志贺毒素、破伤风毒素等。
(2)攻膜毒素(membranedisruptingtype)又名穿孔毒素(pore-formingtoxin)。
无典型的A-B亚单位,其作用机制是在宿主细胞膜上形成小孔,造成胞内液流失而使细胞破坏。
一些溶血毒素及磷酸酯酶属于此类,金黄色葡萄球菌的α毒素是其代表。
若干攻膜毒素具有特殊的分子结构,即9个串联的氨基酸(Leu/Ile/Phe-X-Gly-Gly/X-X- Gly-Asn/Asp-Asp-X)重复出现,称之为重复子毒素(repeatintoxin,PTX),例如猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)及大肠杆菌的溶血素。
(3)超抗原毒素(superantigen)缺乏典型的A-B亚单位结构,它与T细胞结合,释放出细胞因子。
金黄色葡萄球菌的毒素休克综合征毒素1(TSST-1)属于此类。
(二)内毒素(endotoxin)
内毒素特指革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖(LPS)成分,细菌在死亡后破裂或用人工方法裂解菌体后才释放。
革兰氏阳性菌细胞壁中的脂磷壁酸(LTA)具有LPS的绝大多数活性,但无致热功能。
螺旋体、衣原体、立克次体亦含有LPS。
1.组成:
LPS由O特异多糖侧链、非特异核心多糖和类脂A三个部分组成。
具有毒性的部分是类脂A,由一个磷酸化的N乙酰葡萄糖胺(NAG)双体和6~7个饱和脂肪酸组成,它将LPS固定在革兰氏阴性菌的外膜上。
类脂A高度保守,肠杆菌科细菌的类脂A结构完全一样,因此所有革兰氏阴性菌内毒素的毒性作用都大致相同,引致发热、血循环中白细胞聚减、弥散性血管内凝血、休克等,严重时亦可致死。
2.特性:
内毒素耐热,加热100℃经1h仍不被破坏,必须加热160℃经2~4h,或用强酸、强碱或强氧化剂煮沸30min才失活。
不能被甲醛脱毒成类毒素。
内毒素的抗原性较弱,将内毒素注入机体可产生针对其中多糖抗原的相应抗体,但此抗体并无中和内毒素毒毒性的作用。
外毒素和内毒素的主要区别参见表5-1。
表5-1细菌外毒素和内毒素的基本特性比较
特性
外毒素
内毒素
化学性质
蛋白质
脂多糖
产生
由某些革兰氏阳性菌或阴性菌分泌
由革兰氏阴性菌菌体裂解产生
耐热
通常不耐热
极为耐热
毒性作用
特异性。
为细胞毒素、肠毒素或神经毒素,对特定的细胞或组织发挥特定作用
全身性。
致发热、腹泻、呕吐
毒性程度
高,往往致死
弱,很少致死
致热性
对宿主不致热
致热性,常致宿主发热
免疫原性
强,刺激机体产生中和抗体(抗毒素)
较弱,免疫应答不足以中和毒性
能否产生类毒素
能,用甲醛处理
不能
3.检测:
目前通用鲎试验(Limulusassay)。
东方鲎(Tachypleustridentatus)或美洲鲎(Limuluspolyphemus,英文名horseshoecrab)均是海洋节肢动物,其血液中的有核变形细胞能被内毒素所裂解。
商品化的试剂则是用鲎变形细胞溶解物(Limulusamebocytelysate,LAL)试剂,待检样本中的内毒素与之相遇,激活LAL中的凝固酶原成为凝固酶,进而使凝固蛋白凝聚成凝胶状态。
此法敏感,可检出0.01~1/ng/ml的内毒素。
三、Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretionsystem)
细菌的分泌系统的发现是近年细菌致病机制研究的重要进展,其中的Ⅲ型分泌系统与动植物的许多革兰氏阴性病原菌的毒力因子的分泌有关。
在病原菌与宿主细胞接触后,这一系统得以启动,具有接触介导的特征。
启动后细菌分泌与毒力有关的多种蛋白质,与相应的伴侣蛋白结合,从细菌的胞浆直接进入宿主细胞胞浆,发挥毒性作用。
Ⅲ型分泌系统通常由30~40kbp大小的基因组编码,以毒力岛的形式存在于细菌的大质粒或染色体,可能是可转移的外源插入成分,通过水平传递获得。
除Ⅲ型分泌系统之外,革兰氏阴性菌尚有Ⅰ型、Ⅱ型与Ⅳ型分泌系统。
Ⅰ型可将细菌分泌物蛋白质直接从胞浆送达细胞表面。
Ⅱ型则是细菌将蛋白质分泌到周质间隙,经切割加工,然后通过微孔蛋白穿越外膜分泌到胞外。
Ⅲ型与Ⅰ型虽都是一步性分泌,且不被加工,但不同点在于,Ⅲ型需较多蛋白质参与,比Ⅰ型复杂。
Ⅳ型是一种自主运输系统,其分泌的蛋白质需切割加工,而后形成一个孔道使自身穿过外膜。
革兰氏阳性菌的毒力因子分泌相对较为简单,一个信号片段就足以完成分泌过程。
第三节细菌毒力的增强与减弱
在自然条件下,不仅不同菌株的毒力有所不同,就是同一菌株在不同条件下也表现出不同的毒力。
在某种传染病的发病初期,从患病动物体内分离出来的菌株毒力较强,然而在流行末期分离到的细菌毒力大为减弱。
毒力强的菌株在体外连续传代改变培养条件后,毒力往往减弱,而通过易感动物又能使毒力减弱的菌株恢复毒力。
一、细菌毒力减弱的方法
在生产实践中,因制作疫苗等需要,常进行强毒菌株的致弱,以筛选和培育减毒菌株。
致弱菌株常采用的方法有:
长时间在体外连续培养传代;
在高于最适生长温度条件下培养;
在含有特殊化学物质的培养基中培养;
在特殊气体条件下培养;
通过非易感动物;
通过基因工程的方法。
二、细菌毒力增强的方法
要保持保存菌株的毒力,常以回归易感动物为增强细菌毒力的最佳方法。
易感动物既可是本动物,也可是实验动物。
特别是回归易感实验动物,已广泛用于增强细菌的毒力。
三、细菌毒力因子的调节
许多细菌的毒力因子受环境因素的调节,仅在某些特定的条件下才能表达,对细菌毒力有调节作用的环境条件包括温度、铁离子及钙离子浓度、渗透压、pH、氧含量等(表5-2)。
表5-2某些细菌毒力因子的调节系统(据Ryan)
细菌名称
调节基因
环境刺激因素
调节的产物
大肠杆菌(E.coli)
drdX
fur
温度
铁离子浓度
P菌毛
类志贺毒素,载铁体
霍乱弧菌(Vibriocholerae)
toxR
温度,渗透压,pH,氨基酸
霍乱毒素,菌毛,OMP
耶尔森菌(Yersinia)
lcrloci
virF
温度,钙
OMP
粘附,侵袭
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)
pag
pH
毒力,在吞噬细胞内存活
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)
agr
α、β溶血素,毒素休克综合征毒素Ⅰ,A蛋白
1.温度:
温度是许多细菌重要的调节信号,特别是对那些自然生存环境的温度低于宿主体温的细菌,如嗜水气单胞菌的毒素、菌毛等在25℃左右表达量最高。
耶尔森菌的侵袭素(invasin)在室温条件下表达量最高,而YadA及Ail蛋白则必须在37℃条件下方能表达。
志贺菌在30℃培养时不能侵袭宿主细胞,只有在37℃条件下才内化而致腹泻。
2.铁:
铁不仅是细菌必需的生长因子,而且对细菌毒力因子的表达也起调节作用,它不仅可诱导载铁体、载铁体受体及其它铁结合蛋白受体等与铁代谢有关成份的表达,而且还对某些细菌毒素有调节作用,类志贺毒素(Slt1)、铜绿假单胞菌外毒素A、菌毛(大肠杆菌)、鞭毛(霍乱弧菌)、蛋白酶(铜绿假单胞菌碱性蛋白酶、弹性蛋白酶)等。
3.钙:
钙对耶尔森菌Yops的表达有调节作用,在无钙、37℃培养时,耶尔森菌生长停滞,但产生大量的Yops。
Yops是耶尔森菌的一系列外膜蛋白,与其粘附及内化密切相关,是重要的毒力因子。
4.渗透压:
渗透压对霍乱弧菌的毒力及菌毛的表达有调节作用。
在宿主组织相近的生理范围内表达量最高。
此外,铜绿假单胞菌某些菌株的荚膜亦受渗透压的调节。
第二节病毒的致病机理(1学时)
病毒与宿主细胞相互作用的结果可引致宿主的临床和病理变化。
病毒对动物的致病机理包括:
病毒如何侵入宿主防御系统和宿主如何反侵入;
病毒感染如何对宿主组织、器官和整体造成损伤以及宿主如何补偿;
病毒感染如何对免疫系统造成损伤以及宿主如何补偿。
了解病毒动物个体的致病机理是理解动物群体乃至生态系统中病毒致病本质的基础。
一、病毒感染对宿主组织和器官的损伤
病毒致病的严重程度并不与该病毒引起组织细胞的病变程度直接相关,有的病毒能引起组织细胞病变,但不产生临床症状,而有的病毒能引起动物的致死性疾病,但却不产生病变。
病毒所致组织细胞损伤是否产生临床疾病因器官而异,也就是因器官的重要性而异。
(一)、对宿主组织和器官的直接损伤
某些杀细胞性病毒对细胞的直接损伤引致机体的临床症状和病理变化,但病毒种类不同其组织细胞嗜性不同,引起何种组织器官的何种细胞损伤是病毒的特征。
1.对呼吸道上皮的损伤:
呼吸道病毒最初入侵并损伤上皮细胞,逐步损坏呼吸道黏膜的保护层,暴露出越来越多的上皮细胞。
病毒感染早期,呼吸道纤毛摆动实际上有助于子代病毒沿呼吸道扩散。
感染后期当上皮细胞损坏时,纤毛停止摆动。
2.对消化道上皮的损伤:
病毒的消化道感染多数潜伏期短,没有任何前驱症状。
感染消化道的病毒较多,但其感染机制可有所不同。
病毒感染常发生在小肠近端,并逐步向空肠和回肠或结肠扩散。
扩展的程度与病毒的摄入量和毒力以及宿主的免疫状况有关。
随着感染的发展,肠绒毛的吸收细胞被不成熟的立方上皮细胞代替,后者的吸收能力和酶活性虽大为下降,但抵抗病毒感染。
病毒感染引致畜禽腹泻若不因脱水而死,这种病毒感染常常是自限性的(self-limiting),机体能很快康复,尤其是仅侵染肠腺的感染。
(二)、无组织器官损伤时所致的病理变化
某些病毒感染不引起明显的损伤,感染细胞仍处于低效能地执行正常细胞功能,但丧失了系统自身平衡必需的特定功能。
如淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠,由于分泌细胞受病毒感染而使体内生长激素和甲状腺激素低于正常水平,导致感染鼠的侏儒综合征。
(三)、易致细胞继发感染的组织和器官损伤
某些病毒感染除造成直接损伤外,还易使动物发生继发感染。
如副流感病毒3型或其他呼吸道病毒感染奶牛时,损伤纤毛上皮,引起体液渗出到呼吸道中,使曼氏杆菌(即溶血巴氏杆菌)和其他细菌侵入肺,引发继发细菌性肺炎。
二、病毒的持续性感染
急性自限性病毒感染是指动物机体很快能够康复,除多数腹泻和呼吸道病毒感染外,多数病毒感染都有程度不等的慢性症状。
病毒的持续性感染在急性症状转轻或转化为亚临床后,还可引起轻微的慢性疾病。
(一)、持续性感染的类型
持续性感染可以再次激活,引起宿主的疾病复发,并能引致免疫病理疾病,还与肿瘤的形成有关。
病毒能在经免疫的动物体内以持续性感染的方式存活,成为传染源,具有流行病学上的重要性。
持续性感染主要依据持续性感染期间病毒复制的程度和连续性,其次考虑病毒排放和疾病是否发生,可分为以下4种类型。
但某些病毒的持续性感染同时拥有多种类型。
1.持续性感染(persistentinfections):
不论是否发病,感染性病毒终生存在和排放。
可能很迟才发生免疫病理或肿瘤病。
2.潜伏感染(latentinfections):
又名隐性感染,除非激活,
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