海水小球藻紫外诱变优势藻株处理原油污染海水能力的研究Word文件下载.docx

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2.4.2紫外线诱变5

2.4.3诱变后培养及突变株的初步筛选5

2.5蛋白质含量测定5

2.5.1胞外蛋白的测定5

2.5.2胞内蛋白的测定5

2.6多糖的测定5

2.6.1胞外多糖的测定6

2.6.2胞内多糖的测定6

2.7叶绿素与β-胡萝卜素的测定6

3结果6

3.1单细胞分离法初步筛选实验6

3.2紫外线预诱变实验7

3.3诱变后藻株生长状况比较8

3.4出发株与诱变株蛋白含量的比较8

3.5出发株与诱变株多糖含量的比较9

3.6出发株与诱变株色素含量的比较10

3.7原藻株、出发株、诱变株生长曲线比较10

4讨论11

4.1紫外诱导后海水小球藻的生物量的对比分析11

4.2蛋白、多糖、色素含量的整体比对分析12

4.3生长曲线的对比分析12

参考文献14

致谢15

（以下为前半部分工作）

摘要：

利用单细胞分离技术和紫外诱变育种技术，初步筛选优势海水小球藻藻株。

通过单细胞分离技术，获得紫外预诱变的出发藻株。

经预诱变结果显示，在30W紫外灯，照射距离为15cm，照射20min时，诱变株具有最大的生长速度和生物量。

在此条件下，对海水小球藻进行紫外诱导实验，初步筛选培养，测定诱变株蛋白质、多糖、色素等指标，与出发株进行比较，最终得到紫外诱导后的优势藻株A16，其蛋白含量较出发株提高1.18倍，多糖含量较出发株提高1.13倍，色素含量较出发株提高1.24倍，且生长迅速，生活周期长，可用于大规模扩大培养或研究。

关键词：

海水小球藻；

紫外诱导；

蛋白质；

多糖；

色素

PreliminarilyscreeningofthedominantalgaefromtheUV-irradiatedChlorellapacifica

Abstract:

Thisexperimentusesingleseparationtechnologyandultravioletmutationbreedingtechniques,topreliminarilyscreenofthedominantalgae.Throughthesingle-celledseparationtechnologyacquiringtheadvancealgaeinducedbyUV.Theresultsshowedthatinducedmutagenesisalgaein30Wultravioletlamp,irradiationdistancehasfor15cm,illuminate20min,hasthebiggestgrowthstrainsandbiomass.ExperimentonChrysophyteinthisconditionandusingsingleseparationtechnologyseparateinducedmutagenesisalgaetomonoclonalalgae.ObtainthedominantalgaefromtheUV-irradiatedalgaebydeterminingplantproteins,polysaccharide,pigmentcomparingwiththecontrolsample.ThedominantalgaenamedA16is1.18timesthanthecontrolinprotein,1.13timesthanthecontrolinpolysaccharide,1.24timesthanthecontrolinprigment.Thedominantalgaecanbeusedinlargrscaleproducebecauseofitshighrapidgrowthandlonggrowthcycle.

Keywords:

Chlorellapacifica;

UV-irradiated;

Protein;

Polysaccharide;

Pigment

1前言

海水小球藻是绿藻门的一种单细胞藻类，具有生态分布广，易于培养，可快速繁殖和生长，并且粗蛋白含量高，蛋白质品质好等特点。

作为非动物性资源，海水小球藻的必需氨基酸组成基本平衡，所以海水小球藻可作为蛋白质补充饲料。

同时，海水小球藻还含有大量的叶绿素、具生物活性的糖蛋白、多糖及高达13%的核酸等物质[1]，具有很高的应用价值，目前已经广泛地应用在食品添加剂、动物饲料、美容产品、医药制剂等方面。

而在海水小球藻的大规模生产中，高生物量、高蛋白含量的藻种是关键的，如果可能，多糖和色素含量同样有提高的藻种就更是完美。

因此研究者一直致力于筛选生长速度快、蛋白含量高并且其他生物性状有所提高的海水小球藻。

紫外线诱变是农业上一种有效的育种方法。

它干净，易处理，并能使培养达到无菌，深得研究者青睐。

其原理是紫外线照射DNA后，形成嘧啶二聚体，严重影响DNA的复制和转录，引起基因突变和染色体畸变，产生各种各样的变异[2,3]。

通过人工选择再加上育种上的一些措施，可以培育出生产上需要的各种优良品种。

1.1微藻

1.1.1微藻简介

微型藻类，简称微藻，是指那些在显微镜下才能辨别其形态的微小的藻群，有2万多种，且是水生态系统中主要的初级生产者[4]。

根据微藻的生长环境可分为水生微藻、陆生微藻和气生微藻三种类群，其中水生微藻又有淡水生微藻和海水生微藻之分;

根据生活方式的不同又可分为浮游微藻和底栖微藻。

微藻主要利用光能和无机盐类自养生长，对生长环境有很强的适应能力，它们能有效地利用太阳能等光能快速生长繁殖，并能在生长过程中合成与积累许多有开发价值的化合物，是一类具有重要经济价值的生物。

在生长繁殖过程中，微藻细胞可以大量合成与积累油脂、多糖、色素、生物毒素和抗生素等多种特殊的次级代谢物，是新型生物保健食品和生物药品的开发与生产的新资源;

因此倍受世界范围内各研究单位和生产企业的广泛关注。

1.1.2微藻的主要生物学特点

微藻的繁殖方式简单，具有叶绿素等光合器官，能十分有效地利用太阳能。

生长周期较短，生物量容易采取和利用。

可在海水、碱水或半碱水中生长繁殖，是淡水资源短缺地区获得生物资源的重要途径。

富含蛋白质、脂肪和碳水化合物，是重要的食品及油料资源。

微藻能合成许多结构和生理功能独特的生物活性物质，是保健食品和药物的重要来源[5]。

1.1.3微藻的应用价值

1）微藻的研究价值

微藻体中存在着许多结构独特、作用各异的初级和次级代谢产物。

早期的研究工作主要侧重于微藻蛋白质的开发利用。

现代微藻的研究目标主要是微藻整体生物量和高附加值微藻生物活性物质的开发与应用。

目前国内外已商业化或正在开发的微藻产品有：

螺旋藻、盐藻井胡萝卜素、硒多糖、微藻EP、DHA、虾青素、微藻饵料及生产金属硫蛋白的基因工程藻等，主要研究的物质有蛋白质、脂肪类、色素及生物活性物质等[6]。

2）微藻的饵料价值

浮游动植物是水产高等经济动物的天然饵料，也是养殖经济动物幼体不可替代的优质活饵料。

鱼苗、幼体的培育是水产经济动物养殖成功的关键。

然而，鱼苗、幼体的培育的成功与开口饵料的选择是密不可分的。

因为鱼苗、幼体在刚开口摄食时，口径比较小，消化系统发育的还不够完全，运动能力差，因此它要求饵料生物必须具备个体小便于摄食、无细胞壁易于消化、营养全面、能运动不至于沉底、在其繁殖季节藻类能够达到一定的密度等。

微藻具备所有这些条件。

因此，微藻作为鱼苗、幼体繁殖开口饵料具有绝对优势。

1.2绿藻门

1.2.1绿藻门简介

绿藻门（Chlorophyta）是藻类植物中最大的一门，约有430属，6700种。

关于绿藻门的分纲，意见不一，有的学者认为可分为绿藻纲（Chlorophyceae）和轮藻纲（Charophyceae）。

有的学者将轮藻纲分出列为独立的一门。

绿藻的分布很广，以淡水中为最多，流水和静水中都可见到。

陆地上的阴湿处和海水中也有绿藻生长，有的和真菌共生形成地衣。

1.2.2绿藻门生物学特征

绿藻植物的细胞与高等植物相似，也有细胞核和叶绿体，有相似的色素、贮藏养分及细胞壁的成分。

色素中以叶绿素a和b最多，还有叶黄素和胡萝卜素，故呈绿色。

贮藏的营养物质主要为淀粉和油类。

叶绿体内有一至数个淀粉核。

细胞壁的成分主要是纤维素。

游动细胞有2或4条等长的顶生的尾鞭型的鞭毛。

绿藻的体型多种多样，有单细胞、群体、丝状体或叶状体。

繁殖的方式也多样，无性生殖和有性生殖都很普遍，有些种类的生活史有世代交替现象。

1.3海水小球藻

1.3.1海水小球藻简介

海水小球藻（Chtorella.sPP）为绿藻门、小球藻属（Chtorella）单细胞藻，早在20亿年前就出现在地球上，形状呈球形或广椭圆形，直径3~12nm。

其种类繁多，生态类型多样，它能利用光能自养,也能在异养条件下利用有机碳源进行生长繁殖。

海水小球藻生态分布广，生长速度快，容易实现大规模培养，是进行生物技术研究的很好材料，而且其营养丰富，是很好的单细胞蛋白（SCP）来源，具有很高的应用价值。

1.3.2海水小球藻的应用

1）海水小球藻蛋白的饵料价值

海水小球藻的粗蛋白含量很高，可达50%以上，而且蛋白质品质也很好。

作为非动物性资源，海水小球藻的必需氨基酸组成是基本平衡的，达到联合国粮农组织（FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations,FAO）对健康食品8种必需氨基酸的标准[7]。

加之小球藻其独特的生物学特性，使其己经成为水产经济动物养殖中不可缺少的天然饵料，并出了巨大的应用前景。

2）海水小球藻多糖和脂肪酸的保健及药用价值

与蛋白质含量相比，海水小球藻的脂肪和糖类含量都很低，比大豆低得多，粗纤维的含量（1%～4%）介于谷实类之间。

但是海水小球藻细胞内含有的多糖和脂肪酸等多种有效活性成分，具有多种保健和药理作用，如海水小球藻多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗血栓及提高机体的免疫力等作用[8]。

3）海水小球藻色素的应用价值

海水小球藻细胞内富含叶绿素和胡萝卜素，是天然色素生产的原料。

4）海水小球藻的环保价值

在环保方面海水小球藻可应用于污水处理，海水小球藻细胞可直接应用于养殖和生活废水的处理，对污水中氮、磷、重金属、无机盐和农药、烷烃、酚类和油污等多种污染物具有较好的去除效果，在众多藻类中海水小球藻显示出很好的污水处理能力。

另外，由于海水小球藻是光能自养型生物，它可和人形成一个循环系统，即人呼出的CO2可供海水小球藻生长，而海水小球藻产生的O2可供人体呼吸之用，使其在航天领域具有重要的开发价值[9]。

5）海水小球藻的其他应用

海水小球藻细胞中的一些未知的生理活性物质具有活化皮肤细胞、加速新陈代谢和延缓细胞衰老的功效，是优良的化妆品原料；

海水小球藻富含以EPA和DHA为代表的。

一3高度不饱和脂肪酸，从海水小球藻中生产的。

3PUFA无腥味，不含胆固醇，提纯工艺成本低；

此外，海水小球藻的提取物中还有抗氧化成分，可作为油脂食品生产的生物抗氧化剂。

经过热处理和破壁处理的海水小球藻，可直接制成海水小球藻片、海水小球藻颗粒剂或海水小球藻胶囊，可用于高血压、高血脂、动脉粥样硬化、冠心病、消化性溃疡、免疫功能低下等多种疾病的预防和辅助治疗，还可用于放疗和化疗辅助治疗药品[7]。

1.4海水小球藻的紫外诱导

海水小球藻有着蛋白含量高、必需氨基酸组成是基本平衡、多糖及脂类有很高的应价值的特点，但是个体间差异较大。

为了进行大规模生产要选择具有性状优良并稳定的藻株。

紫外线对高等植物具有较强的生物学效应，能够在农业上进行诱变育种。

紫外线照射DNA后，形成嘧啶二聚体，严重影响DNA的复制和转录，引起基因突变和染色体畸变，产生各种各样的变异[11-18]。

通过人工选择再加上育种上的一些措施,，以培育出生产上需要的各种优良品种。

本文先利用单细胞分离技术从实验室保存的藻种中分离出生长快、蛋白含量高的株系，然后将其作为出发株，进行紫外线诱变育种。

2实验材料与方法

2.1实验材料

海水小球藻（ChtorellasP.MACC/C95）藻种由大连理工大学提供。

2.2培养液成分

NaHCO30.30g/L，NH4NO30.50g/L，KH2PO40.08g/L，VB10.60mg/L，VB122.0µ

g/L，海水（取自大连水产大学附近海域，并经0.42nm滤膜过滤纯化）

2.3单细胞分离技术获得紫外诱变出发株

取对数期生长的海水小球藻，分别稀释10，100，1000和10000倍涂抹于固体培养基上，在23℃，光照100µ

mol/（m2·

s）[19]，光周期12L/12D的条件下培养。

7天（d）后挑取色单克隆藻落接种于液体培养液中，选用100mL三角瓶，内有50mL培养液。

共挑取了20个单克隆藻落，在与前相同的条件下培养，每天摇动2次。

14d后，去除贴壁严重的和颜色发白的，挑选出5株藻液颜色呈浓绿色、不贴壁的海水小球藻。

将这5株海水小球藻分别接种于新的液体培养液，2个平行样，相同培养条件下，每天摇动2次，以原有海水小球藻种作为对照，每天计算它们的细胞密度。

8d后，根据其生长速度和最终生物量，挑选出1株海水小球藻，生长速度和生物量均大于对照，且藻液浓绿色，无贴壁现象。

传代培养后，作为紫外诱导的出发藻株。

2.4紫外线诱变处理

2.4.1紫外预诱变实验　　

取对数生长期的出发株藻液3mL置小培养皿中，使藻液在培养皿底部铺一薄层，参照其他相关研究[10-13,19]，用30W的紫外灯，照射距离为15cm进行不同时间的照射，分别为：

0、1、5、10、15、20、25、30min，设置3个平行样。

根据致死率，确定适合本实验的诱变剂量。

2.4.2紫外线诱变　　

以上述预试验中确定的诱变剂量对出发株进行诱变。

紫外诱导组和对照组分别设置3个平行样。

2.4.3诱变后培养及突变株的初步筛选　　

诱变后将藻液立即转移到暗处，遮光5h以避免光修复。

5h后将藻液分别转移到50mL的三角瓶中，各加15mL液体培养液后在23℃，光照100µ

s）[20]，光周期12L/12D的条件下培养。

3d后将藻液涂于固体培养基上，每个平行样涂3个板，共9个板做好标记。

12d后，从各平板中挑取体积较大、颜色浓绿的藻落18株分别于100mL三角瓶中培养，培养液体积为50mL，在与前相同条件下培养。

（其中诱变藻株18株：

A1-A18，对照藻株为出发株3株：

B1-B3）以B1-B3的平均值为对照，每隔2天计算细胞密度，17d后，测定蛋白、多糖、色素等指标。

2.5蛋白质含量测定

蛋白质标准曲线的建立：

经回归分析，可得直线方程为y=1.1057x-0.0356，回归率R2=0.996，其中，y为吸光度，x为蛋白质含量（mg）。

2.5.1胞外蛋白的测定

取海水小球藻藻液10mL，3000r/min离心10min取上清液，藻泥收集后待用。

取1mL上清液加入3mL双缩脲试剂，混匀后放置30min，取3mL于比色皿中；

以1mL培养液+3mL双缩脲试剂混匀后取3mL为对照，测定540nm波长处的吸光度。

根据标准蛋白质曲线可确定样品中的蛋白质含量。

2.5.2胞内蛋白的测定

向上步所得藻泥中加入10ml培养液，在－30℃温度下进行反复冻融，采用每次冷冻20min，37℃温水浴中融解5min，共反复6次的方法。

充分振荡后，在3000r/min下离心10min取上清液。

将1mL上清液加入3mL双缩脲试剂，混匀后放置30min，取3mL于比色皿中；

2.6多糖的测定

葡萄糖标准曲线的建立：

经回归分析，可得直线方程为y=0.7619x+0.1676，回归率R2=0.9887，其中，y为吸光度，x为多糖含量（mg）。

2.6.1胞外多糖的测定

取海水小球藻藻液10mL，3000r/min离心10min，藻泥收集后待用。

取上清液1mL加入0.1mLZnSO4，沸水浴5min，立即加入亚铁氰化钾0.1mL，离心10min，取上清液1mL加到3mL蒽酮中，沸水浴10min，用冷水迅速冷却至室温，稳定后测定620nm波长处的吸光度。

根据标准葡萄糖曲线可确定样品中多糖的含量。

2.6.2胞内多糖的测定

将上清液1mL加入0.1mLZnSO4，沸水浴5min，立即加入亚铁氰化钾0.1mL，离心10min，取上清液1mL加到3mL蒽酮中，沸水浴10min，用冷水迅速冷却至室温，稳定后测定620nm波长处的吸光度。

2.7叶绿素与β-胡萝卜素的测定

取海水小球藻藻液10mL，3000r/min离心10min，弃去上清液。

向藻泥中加入10ml培养液在－30℃温度下进行冻融，采用每次冷冻20min，37℃温水浴中融解5min，共反复6次的方法。

充分振荡后，在3000r/min下离心10min，弃去沉淀。

将1ml上清液与4ml无水丙酮混合均匀，静置30min。

待溶液分层后，取上层溶液，加入比色皿中。

以无水的丙酮为对照，分别测定645nm、663nm、450nm处的吸光度。

计算叶绿素含量公式：

叶绿素（mg/L）=（8.02OD663+20.2×

OD645）×

N，N一稀释倍数。

计算β-胡萝卜素含量素公式：

β-胡萝卜素（mg/L）=OD450×

N×

10×

1000/2500，N一稀释倍数，l%的胡萝卜素色价为2500。

3结果

3.1单细胞分离法初步筛选实验

最后一轮的5株海水小球藻筛选时，在起始密度相同，培养条件相同的情况下，培养第14天，藻细胞的生长状况见图表，M4的终细胞密度为37.21×

106/mL（见图3-1-1），高于对照24.51×

106/mL和其他株海水小球藻，而且颜色浓绿，细胞分散均匀，无结块，沉底的藻细胞经轻轻摇动即可浮起，不紧附于底部。

从蛋白含量上来看（见图3-1-2），最高的是M2达到65.13%，其次是M4为60.81%。

但M2株系终细胞密度显著低于对照株，生长速率不理想，因此，选择M4作为紫外诱变的出发株。

细胞密度（106/mL）

图3-1-1单细胞分离藻株的终密度（细胞密度单位为106mL-1）

图3-1-2单细胞分离藻株蛋白含量

3.2紫外线预诱变实验

用紫外线照射处理海水小球藻细胞后，藻液颜色由原来的绿色逐渐变浅甚至变白色，照射时间越长，颜色越浅，照射时间为1、5、10、15min的藻液逐渐变为浅绿，照射时间为20、25、30min的藻液颜色变得更浅，接近于白色，30min的藻液可看到有糁装固体。

在显微镜下观察并统计，死亡率随着照射时间的延长升高。

在照射后第3天时，藻细胞死亡率稳定下来，统计其死亡率（见图3-2）。

实验中使用的各种紫外线剂量对小球藻细胞都有致死作用，辐射时间从15min增至25min时，藻细胞死亡率增加2倍多，说明此时的辐射量是处于多数细胞的敏感区域与耐受极限。

为了获得较多的突变型，又不至于因为辐射剂量过大造成大部分细胞死亡而残留一些不活跃的细胞，作者认为30W紫外灯、照射距离15cm、辐射时间20min适合本次实验。

图3-2不同剂量紫外照射致死率（注：

图中数据为3个重复组平均数）

3.3诱变后海水小球藻生长状况比较

在最后一轮的18株藻培养17d后，终细胞密度最高的6株藻为A1、A3、A5、A8、A9、A16。

这6株藻株的终密度由高到低的顺序排列依次为A9为46.30×

106/mL，A16为45.49×

106/mL，A1为43.65×

106/mL，A5为42.19×

106/mL，A8为41.76×

106/mL，A3为40.12×

106/mL，高于对照株B1-B3的平均值28.93×

106/mL及其他株藻。

在培养过程中藻液由鲜绿到浓绿，藻细胞分布均匀，不沉底，不贴壁，这些都是在大生产中优良株系应具备的生理特征。

根据其细胞密度的特点，选择这6株诱变株进行以下生长曲线及蛋白、多糖、色素的测定以进一步筛选优势藻株。

图3-3诱变后藻株生长状况比较

3.4出发株与诱变株蛋白含量的比较

图3-4为出发株与诱变株蛋白含量的比较，诱变株选取A1、A3、A5、A8、A9、A16六株生长较好的进行蛋白含量的测定。

所测得的诱变株胞内蛋白含量均高于出发株胞内蛋白含量，其中出发株为46.45mg/L，诱变株中A16最高为54.85mg/L，其次为诱变株A1为54.37mg/L，再次为诱变株A9为53.38mg/L。

胞外蛋白测定中，出发株最低为11.52mg/L，诱变株中A16最高为13.74mg/L，其次为A1为13.0mg/L，再次为A9为12.31mg/L，综上特点，诱变株A1蛋白总量较出发株提高1.16倍，诱变株A9蛋白总量较出发株提高1.13倍，诱变株A16蛋白总量较出发株提高1.18倍，故得到诱变株A1、A9、A16为蛋白含量较高的优势藻株。

图3-4出发株与诱变株蛋白含量的比较

3.5出发株与诱变株多糖含量的比较

图3-5为出发株与诱变株多糖含量的比较，所测数据显示胞内多糖含量和胞外多糖含量基本持平。

胞内多糖测定中，出发株为2.34mg/L，最高为诱变株A16：

2.73mg/L，其次为诱变株A8为2.59mg/L，再次为诱变株A5为2.47mg/L。

胞外多糖测定中，出发株为2.07mg/L，最高为诱变株A5为2.35mg/L，其次为诱变株A3为2.34mg/L，再次为诱变株A9为2.32mg/L。

综合测得的结果的特点发现诱变后对多糖的影响不是很大，胞内多糖和胞外多糖的变化不一，从胞内多糖和胞外多糖的整体来看，诱变株A5多糖总量较出发株提高1.09倍，诱变株A8多糖总量较出发株提高1.11倍，诱变株A16多糖总量较出发株提高1.13倍，诱变株A5、A8、A16为多糖含量较高的优势藻株。

图3-5出发株与诱变株多糖含量的比较

3.6出发株与诱变株色素