外文翻译蛋白质抗聚环氧乙烷接枝表面多种药物的作用机制讲解Word格式.docx
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椭圆偏振法通常是用于确定聚环氧乙烷的吸附动力学,确定最终聚环氧乙烷链密度和蛋白质的吸附动力学以及最终蛋白质的吸附量。
用这种方法,有可能确定的聚环氧乙烷远侧化学(-OH的影响,-OCH3),链长,和一层上的蛋白质吸附水分。
所获得的数据表明,相关的属性以链密度(构象自由,水化)是蛋白质阻力位链的密度主要决定因素高达0.5chain/nm2一临界值;
在这个值时,蛋白质的吸附是一个最小的甲氧基封端私立教育机构。
用于羟基封端的聚环氧乙烷,吸附在临界值趋于平缓。
因此远端出现化学是蛋白抗性的在链的密度大于临界值的主要决定因素。
介绍
最终拴聚在材料-组织界面的存在(环氧乙烷)(聚环氧乙烷)有效地阻止非特异性的蛋白质的吸附作用。
蛋白的抗性是由聚环氧乙烷链的长度,密度,水化,构象的影响,以及化学“自由”链端(以下称为“远端化学”)的身份阐明的聚环氧乙烷基蛋白抗性机制的困难来自于一个事实,即许多这些因素是相互依存的。
例如,它是公知的,这两个链构象和水化依赖于链密度;
因而一个合适的实验模型,目前它允许这些因素独立变化是需要提前了解分子机制。
该本文报道的研究的假设是,仅由链密度的基础上,比较系统才有可能确定链长,构象,水化和远侧化学的(例如,-OH,-OCH3)明确抵抗非特异性蛋白质吸附。
它也被推测,通过测定吸附动力学,它应该有可能推断出的蛋白质吸附的“机制”作为链密度的函数。
PEO是一种两亲性聚合物,当与水接触时其主要存在于两极间的邻位交叉构象,从2.88Å
中分离出O-O键,类似于分离2.85Å
中O-O键得到水中的氢键。
螺旋构造,与周围的水分子,一直假定为一个热力学上有利的水合状态PEO在溶液中,以及2-3个水分子/PEO单体段已被确立为水合作用的最低要求。
常用来形容的机制范围内的PEO表面蛋白质的抵抗性质包括“立体”的障碍,“水化”障碍。
前者是一般用来解释较高分子量的蛋白抗性性质PEO的重量,而后者已提前解释寡核苷酸(环氧乙烷)的抗性(OEO)。
虽然不是很清楚原理,但是在抑制蛋白质的吸附PEO和OEO表面改进中水的作用显然是重要的。
相对于较高分子量的PEO,大多数远端化学对抵抗蛋白质吸附效果影响的研究都是通过OEO实现的。
对于OEO系统,它已被证明在一些研究该蛋白质的吸附是不受远端化学影响的,而其他一些国家报道有重要的影响,尽管进行了广泛的研究,缺乏对链长度对蛋白质的阻力的影响的了解达成了共识。
已经有报道了蛋白质显著抵抗1-3个EO单元链是可以实现的,其他团体已指定不同的最低链长度包括35,15和值为35-100的EO单元。
还有一些人推断蛋白质抗性是独立的链长度。
已经制定模型来解释PEO的蛋白抗性的性质,在其中它被建议该PEO链密度是相关的最重要的因素与蛋白质吸附作用一样也一直抑制它。
还有的认为蛋白质吸附的动力学依赖于表面的结构:
快速吸附可能表明该蛋白具有畅通无阻的表面结构,并只限于扩散,而吸附速度较慢表示增分子间的相互作用(蛋白质聚合物)阻碍蛋白质吸附(即所谓的势垒)。
Kingshott等人表明蛋白质的吸附水平低的时候是PEO在浊点条件,并于表面高得多的嫁接条件远离浊点下形成的,这种差异归因于靠近浊点越高链密度。
澄清这些机制的进展受到在设计的去耦效果的实验难度链长,链密度,链水化和远端化学的阻碍。
如今的工作,为了已知链长的PEO(600-2000MW)的链端和末端化学基(-OH和-OCH3)准备一系列的表面材料,使得所述链密度可以用一些精度来测量。
通过使用这些表面材料,链长,链密度,链水化和远端化学对蛋白质抗性的影响进行评估。
该表面材料是通过末端硫醇化PEO的吸附到镀金硅(末端化学基有-OH或-OCH3)制备的。
链密度的不同是通过控制PEO溶解的吸附介质和潜伏期,为了研究这些表面的蛋白质,耐纤维蛋白原(Fg)和溶菌酶(Lys)常用作模型蛋白。
材料和方法
表面。
α,ω-聚甲氧羟基(环氧乙烷)(分子量为750和2000)和α,ω-聚二羟基(氧化乙烯)(分子量为600)都是从海鸥聚合物公司(亨茨维尔,阿拉巴马州)购买和其他地方描述的链端硫醇化一样。
分子量为600,750和2000的聚合物的多分散性指数(PDI)是确定的,通过标准的凝胶渗透色谱(GPC)测定技术,在硫醇不变的条件下,发现系数分别为1.04,1.04,和1.05。
为了防止硫醇两个羟基基团都在分子量为600的PEO上,使用羟基:
硫醇的比例为2:
1。
这两种纤维蛋白原和溶菌酶购自Sigma-Aldrich公司,并无需进一步纯化即可使用。
先前的化学吸附是将镀金的硅晶片(薄膜技术,布尔顿,CA)浸没在溶液中清洗5分钟,溶液组成为一个部分(V/V)30%过氧化氢水溶液,一部分30%的氢氧化铵,和5份80℃的水,再超声处理1分钟,并用Millipore公司的超纯水清洗。
清洗完后,镀金表面在去离子水中进行水浴预热,接着放在空气中得到5mM的硫醇化PEO产品:
分子量为750或2000的HS-PEO-OCH3或分子量为600的HS-PEO-OH。
利用化学吸附法生成产品的条件(表1)选择为接近PEO的浊点。
在之前的工作中,我们发现,高密度连锁可以在这些条件下得以实现。
在10min-4h内不同的化学吸附时间得到的链密度也不同。
下列化学吸附,晶片被放置在含超纯水的多孔板中,超声处理4分钟,并多次用水漂洗。
表面无需烘干立即置于在含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,再用椭偏仪测定链密度。
将蛋白质加入与PBS溶液中(最终浓度为1mg/mL),继续进行3小时的吸附。
为了表面不与空气接触,将部分溶液去除,并用刚配的PBS溶液稀释。
这样渐进地冲洗三次。
用光谱仪测蛋白质的吸附表面。
这种方法可以直接比较蛋白质吸附和水合链之间的关系。
表1.化学吸附条件
PEO摩尔质量,g/mol
温度,℃
离子强度,M
600
25
4.4
750
35
2.9
2000
2.8
PEO浓度为5mM;
pH为7.4±
0.1。
椭圆偏光仪。
一种能自动校零,单波长(6328Å
)椭圆偏光仪(产于2000年,加拿大的滑铁卢数码电子),通常以70°
的入射角来确定PEO和蛋白质的表面吸附。
在分析PEO和蛋白质的吸附层时是在一个专门建造的玻璃湿细胞进行的(Hellma,Mü
llheim,Germany)与窗的角度固定在70°
。
对所有表面的折射率(ns)和消光系数(ks)进行评估,发现在单波长为632.8nm下测得值分别为0.33
0.01和3.3
0.01。
对于修改后的表面,测定厚度值的条件是偏光片(P)和分析器(A)角度为零。
用复数折射率的固定值(ni+
ki)来现场测定PEO和吸附蛋白层:
PEO和吸附的蛋白质层水性介质同时为1.33+
0和1.37+
0。
这是必要的事实,由于这些层过薄,因此允许同时测定这两个平均厚度和折射率的椭圆偏振数据。
假定折射率的有效性进行如下测试,在一个合理的折射范围内,确定一组折射率和厚度;
这些值被用来计算吸附量和这些被认为是独立的折射率值。
最终厚度值是通过对实验数据拟合到一个三重模型获得:
水性介质-PEO-金或水性介质-PEO/金。
计算方案结果和2000产的椭圆偏光仪测(滑铁卢数码电子)的相当。
根据表征结果得出这些表面材料能更好地避免吸附过程中发生的相互作用,尤其是在需要进行洗涤和干燥的表面上。
现场测定PEO和蛋白吸附量分别通过使用Feijter方程来估算,
式一:
(1)
式中的吸附量(
)是平均厚度(d)由椭偏测量返回的函数,该层(nf)和水性介质(na)的折射率,具体折射率增量(dn/dc之间的差)。
后者占的原子浓度对总层折射率层中的影响相当于0.134cm3/g为PEO和0.188cm3/g为纤维蛋白原以及溶菌酶。
通过使用的链分子量和阿伏伽德罗数,
(每平方厘米克)转化为链密度(每平方纳米链)。
该PEO和蛋白质的吸附率从吸附轮廓的初始斜率估计。
估计中水分子与PEO单体单元的比率。
利用Alexander开发的标度关系来估计的高分子量高延伸链组成的最终栓聚合物层的长度,式二:
(2)
式中聚合物长度(L)为每链单体的数目(
),PEO单体尺寸(a,0.35nm)以及接枝点相邻的链之间的距离(
)的函数。
因为这个形式主要是长链和层面的关系不涉及层内,它可以在目前的工作中提供唯一的近似层的厚度值。
每PEO单体水分子(
)的数目的估计值可以从等式3获得:
(3)
式中
是由一个单一的PEO链(反链密度)所占据的表面积,
是一个PEO单体残基(65Å
3)的体积,并且
是一个水分子(约14.6Å
3)的体积。
结果与讨论
PEO化学吸附和图层属性。
通过原位椭圆偏振测定PEO链密度数据示于图1。
它可以看出,链密度增加化学吸附时间的增加,其值范围为0.6〜2.8,0.2〜2.3,和0.18至0.98chains/nm2分别是分子量为600,750,和2000的PEO系统。
估计这些值类似于(在某些情况下大于)各自的密度为0.3,0.24和0.09chain/nm2分子量为600,750,和2000的PEO,但估计最低上限5.8chains/nm2为完全伸展PEO链。
因此,看来在所有情况下,化学吸附的PEO的各层都有相应的性质。
正如图1,比较化学吸附条件发现,随着PEO分子量的增大链密度降低。
这些密度值似乎明显大于其他相关数据。
例如,PEO结合的磷脂,在空气-水界面上,分子量为120,2000和5000的PEO密度为1.16,0.20,0.23chains/nm2。
分子量2000的PEO连接到通过硅烷化二氧化硅的方法得到的最大链密度为0.4chain/nm2。
在目前的工作中所取得的高密度链可能是由于溶解度低条件下的链处于收缩状态。
图1.在对低溶解度的条件下形成作为化学吸附时间的函数的600-OH,750-OCH3和2000-OCH3层原位PEO链密度。
作出图线,数据为平均值±
SD,n=4
表2.PEO水化和初始纤维蛋白原和溶菌酶的吸附率的估计程度
表3.PEO化学吸附反应动力学
PEO摩尔质量,
g/mol
初始速率,
chains/(nm2·
h)
最终速率,
0.7
1.2
0.3
0.8
0.1
关于形成的动力学数据都在图1和表3中有所表现。
分子量为600的系统显示的恒定链密度短暂,并研究该时间间隔期间没有达到饱和吸附量平台期。
根据图1显示,我们能够合理地得出结论:
分子量为600和750的PEO分子同样形成薄膜时其化学吸附方式类似。
图中显示无论分子量是750或2000都符合Langmuir分布规律,其特征在于,初始吸附后快速到达一个更高的平台。
伴随着一个准平坦区域的最初的吸附。
对于这些膜,750和2000分子量的系统偏离直线反应时间的最初的吸附动力接近0.5个链条每平方纳米,这意味着对潜在的金质基底的直接访问在此链条密度下被阻碍了(即自我抑制条件获得)。
应当指出最初和最终聚合物参入的比例伴随着聚氧化乙烯分子量的增加而增加,可能是因为与发展层长链的并入有关的位阻现象。
由于在600个自由基分子量的聚氧化乙烯系统中低密度导致的充分数据的缺乏,分离的最初速率不能被精确地决定。
有关聚氧化乙烯水合链密度的影响,被表示成每个聚氧化乙烯的水分子数目,如表2所示。
正如所见到的,水合作用伴随着链密度的增加而增加,600,750和2000分子量聚氧化乙烯系统范围分别在11和1,28和2,30和7之间。
特别有趣的是,对于750分子量聚氧化乙烯水合作用的等级接近于0.5个链每平方纳米被决定为9-17,这和先前已发布的原位中子反射测量仪显示的每个聚氧化乙烯8个水分子是相似的。
不符合的状况可能是由于应用在在目前的工作中的相似率关系仅仅估计了链的长度。
600和750分子量表面有最高的链密度0.5-1.5和1.6-2.4水分子每个聚氧化乙烯单体,近于估计的基础化学溶解必要的每个聚氧化乙烯2-3个水分子。
这些数据表明当链密度增加时,分子量600和750的膜接近聚氧化乙烯溶解极限,与先前显示750分子量的膜高链密度可能形成相分离并增加蛋白质的吸附作用。
2000分子量聚氧化乙烯的膜伴随着最高的链密度显示出每个聚氧化乙烯6-8个水分子的水合等级,表明了聚氧化乙烯进一步并入膜的过程被先前吸附的分子所抑制,并不是由于溶解的局限性。
蛋白质吸附:
链长度的影响。
有关纤维蛋白原和溶解酶素在未修改的金(x轴的零点)和750分子量-OCH3根,2000分子量-OCH3根表面吸附作用的相关数据显示在图2和3。
在整个链密度范围内,750和2000分子量系统显示了相似的纤维蛋白原和溶解酶素吸附作用。
750和2000分子量系统分别显示在中间链密度为0.4-0.6和0.3-0.6个链/平方纳米时,纤维蛋白原吸附极小值为11.1-12.1和19-21ng/cm2。
对于750和2000分子量聚氧化乙烯系统中,相似的溶解酶素吸附最小值在0.5个链/平方纳米下分别为20-24和11-19ng/cm2。
有趣的是在蛋白质吸附过程中的这些极小值也出现在接近此链密度的条件下,在这些情形中,聚氧化乙烯膜的形成开始受制于已被吸附的分子(也就是自我拒绝体系的起点)。
这表明这些聚氧化乙烯膜能够阻碍蛋白质的合并,例如纤维蛋白原和溶解酶素以及聚氧化乙烯它自己。
另外,对于750和2000分子量的膜在接近的关键链密度下,初始的蛋白质吸附速率也是相似的。
即是说,在1ng/(cm2·
min)情况下,对于这些体系吸附作用的空间栅栏的有效性是相似的。
图2.纤维蛋白质对于改良聚氧化乙烯表面的吸附作为链密度的函数:
在3小时后的数据。
在0链密度下未改性控制的吸附以灰色的三角形表示。
线条勾勒出了轮廓。
数据为均值标准差n=4。
图3.溶解酶素对于改良聚氧化乙烯表面的吸附作为链密度的函数:
在低密度体制下,750和2000分子量系统一个重要的不同是可见的。
对于纤维蛋白原,这两个系统没有不同,但是对于溶解酶素有一个很重要的不同。
在最低链密度下,在750分子量分子表面的溶解酶吸附比2000分子量要强,这可能是因为后者比起较短的750分子量的链,能够通过影响一个大的表面区域从而更有效抵制较小蛋白质的吸附。
这个结果阐明了在低链密度下,在抵制蛋白质吸附过程中,链的长度可能提供一个辅助作用。
在先前的工作中,我们使用1号示踪的蛋白质测量吸附作用。
对于750和2000分子量聚氧化乙烯表面相似的设置,纤维蛋白原吸附极小值也在密度0.5条链/平方纳米下观察。
对于相似的聚氧化乙烯系统在0.5的链密度下,纤维蛋白原和溶解酶素吸附值分别为40和60ng/cm2;
也就是完全吸附的数目远大于目前的工作中那些原位椭偏仪确定的数值。
这个不同的原因还不清楚,但是,对于750和2000分子量表面纤维蛋白原吸附(比起未改性的金)的降低被发现对于两种方式是相似的(90%通过椭偏仪,83%通过放射性标记)。
最少吸附量的存在表明存在一个最优面链密度,从而在最佳水合状态下,获得相关的最大抗性蛋白。
从这两个750和2000分子量的蛋白质吸附与链密度的数据可以看出其几乎重合得十分密切。
这些结果强烈地表明蛋白质吸附到PEO嫁枝表面受链密度的影响(包括相关链构象和水合作用)非常敏感,而受链长影响较少。
据调查,这一概念已提出各种模型,但至今因没有令人信服的实验证据而不被支持。
“关键”链密度的链构象和水化。
这是有价值的,考虑在其最小的吸附发生在分子量为750和2000的表面和吸附的链密度的值开始稳定下来与分子量为600的表面是相似的,即约为0.5chain/nm2。
对于溶菌酶,在链密度0.62,0.50,和0.44chain/nm2的600,750,和2000分子量分子量表面吸附量分别约27,22,和14ng/cm2,(图3)。
这表明,当价值链密度接近这个“关键”值,既不是链长,也不是远端化学性质,价值链密度是蛋白质性的重要决定因素。
此外,应该指出的是,这些表面的水合状态是相似的,用约11,13,和15水分子/EO残基是分子量为600,750,和2000的PEO层。
特别令人注意的是750和2000系统里面的水:
EO比平均约为14。
已被Heuberger等37人证明的是,对于包含2000分子量的OCH3PEO嫁枝到聚-L-赖氨酸基片的表面,达到最大蛋白电阻时的水合程度为约10。
这些作者建议,在这些条件下,存在PEO和水的弱平衡网络,这能解释这种表面的蛋白电阻。
在本工作中,对于750和2000的层,它可能是在临界链密度时一个类似的水合PEO网络的形成(并且仅在此链密度)。
一个事实,即10-14个水分子/EO残留水分含量超过了预期紧密结合的水化层(2-3个水分子/PEO单体)招人也有力地表明,超过第一水合层相关的水可能有助于PEO不污结的性质。
末节化学效应。
如图2和图3中可见,羟基封端的600分子量表面变现出异于甲氧基封端的PEO层的蛋白质的吸附行为。
而甲氧基封端的表面在中间链密度表现出极小的吸附,羟基封端的表面也没有。
相反,吸附量的持续减少而链密度持续增加,并在接近看到的甲氧基封端的表面的极小值趋于平缓。
对于溶菌酶,在600-OH层表现出吸附性减少而链密度增加直至达到约7ng/cm2低级平稳值,而750和2000-OCH3层在链密度最小值分别表现为22ng/cm2与0.5chain/nm2。
超过极小时,随链密度的增加的吸附性变大,从而导致这种情况下750-OCH3层的吸附量是接近其为改变时的量。
这些数据表明,当链密度大于约0.5chain/nm2远侧化学开始影响蛋白质吸附性直到PEO层。
类似于比较羟基和甲氧基封端的PEO层,高密度链的应该允许远端化学作用的有效评估,因为它是可预期的,高密度链的PEO链将采取伸展的构象,从而相对于接触媒介形成它们各自的密度相当端基。
溶菌酶的远端化学作用似乎比纤维蛋白原强,这可能是由于溶菌酶比纤维蛋白原小得多并且可能对区域的表面性能更敏感。
因此,在高链密度区域,溶菌酶吸附750-OCH3PEO至比600-OH大几乎9倍;
纤维蛋白原吸附至7倍以上。
对于600-OH上的PEO曲面的吸附最低限度的缺乏表明,随着链密度的增加到更高的水平,PEO-溶液接口上高密度的羟(基)氢氧基团抵消了相关的到水化还原中的任何会促进蛋白质吸附的影响。
考虑相对于远端的化学效应的吸附动力学是有作用的。
某些模型表明,对于PEO变性表面,分子间的相互作用(蛋白质—聚合物和蛋白质)产生对于吸附的立体障碍会导致其相关较慢的吸附动力学问题。
在本研究中,与链密度和水化程度相应的初始蛋白质的吸附率,总结于表2中。
为600-OH的PEO系统,随着链密度的增加,初始纤维蛋白原吸附率从3降低并恒定在1.5ng/(cm2/min)。
初始溶菌酶率从18降低到最低限度的0.2,然后增加至5ng/(cm2/min)。
令人感兴趣的是纤维蛋白原和溶菌酶吸附到低链密度的600-OH分子量系统的速率。
溶菌酶的初始吸附速率从18大幅减少到1ng/(cm2/min),在600-OH系统中,为得到更大的蛋白质纤维蛋白原的类似的链密度没有找到。
较小溶菌酶的初始吸附对于低范围的链密度显然是高度敏感的,因此,在这些系统中,对于蛋白质抗性的变性存在一个严苛的链密度临界值。
这种行为是前面提到的为由分子量为750、2000和5000PEO组成的类似的表面,其中这两个溶菌酶和纤维蛋白原步骤变化的平衡吸附量观察到是链密度的函数。
600-OH表面的溶菌酶的吸附率随着链密度从1.5增加到2.9chain/(nm2/min)而从0.2增加到5ng(nm2/min)。
这可能表明一个临界链密度值,当高于该蛋白质的吸附时会显著增加。
姜和同事观察到羟基的OEO的表面类似的趋势,蛋白质的平衡吸附量最初减少,然后在非常高的链密度时增加了。
对于750-OCH3系统随着链密度增加,初始纤维蛋白原和溶菌酶的吸附率最低值约1-1.5ng/(cm2·
min),其中0.5链/nm2与最低吸附率产生重合带(图2和图3)。
2000-OCH3层表现出类似的趋势。
在较高密度的链中的甲氧基封端的系统的吸附率的增加支持了这一观点,该对吸附的障碍的减少,而这种现象直接关系到甲氧基团的水性PEO界面的密度增加。
这些数据表明,在链的密度大于约0.5chain/nm2的临界值时,远侧化学有对吸附的两个速率和蛋白质的最终吸附量有很强的影响。
PEO无污染作用机制。
它是由提出该蛋白质吸附的抑制作用结束-拴系的PEO层主要由链密度,因而所得到的链构象决定的数据明显。
它似乎抑制大和小蛋白质的吸附的基本要求是一种刷型层的形成由数据所指示的对密度的750-OCH3和2000-OCH3层≤0.2chain/nm2。
可能是由于较长链的更有效的覆盖范围,在750-OCH3层并未提供对更小的溶菌酶分子的吸附的有效屏障,而分子量为2000的PEO层既抑制纤维蛋白原和溶菌酶的吸附。
当链密度接近0.5chain/nm2的临界值时,所有链的长度和远端化学组成唯一确定的是所有的表面都和蛋白质吸附是由链密度自吸附量分别相同的。
在超出此临界值的链密度,远端化学作用占主导地位。
PEO随着链密度的增大吸附作用加强的原因现在还不完全清楚。
内部的PEO层和随之而来的构象缺乏自由的脱水不能完全解释这一原因,因为如果是这样的话,应该是600-OH层增加吸附,这大概也有类似750-OCH3和2000-OCH3层的水化/构象状态。
相反,它似乎是甲氧基的相对密集阵列促进增加蛋白质的吸附,而羟基基本无影响。
这个建议甲氧效果是通过在较高的链密度下观察到的增加起始蛋白质的吸附率的支持。
这可能表明,终
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